[发明专利]酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂，其特征在于由酵母融合菌、白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)、根霉菌(Rhizopus)和液体培养基组成，所述的酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461；

所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂的制备方法，有如下步骤：

A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：

a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.菌种的培养：分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；

B液体培养基的制备及液体菌种的培养：

a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；

b.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；

c.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；

d.分别将重量百分比为酵母融合菌为55～65％、白地霉菌为30～35％、根霉菌为5～10％三级菌种再扩大培养，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌混合菌剂,分装。

2.如权利要求1所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂，其特征在于所述的酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原 生质体；将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗，涂布于高渗选择型培养基和高渗完全培养基平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出酵母融合菌。

3.一种酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂的制备方法，其特征在于由酵母融合菌、白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)、根霉菌(Rhizopus)和液体培养基组成，

所述的酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461；

所述的酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌液体菌剂的制备方法，有如下步骤：

A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：

a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.菌种的培养：分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；

B液体培养基的制备及液体菌种的培养：

a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；

b.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；

c.分别取酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；

d.分别将重量百分比为酵母融合菌为55～65％、白地霉菌为30～35％、根霉菌为5～10％三级菌种再扩大培养，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为酵母融合菌、白地霉菌和根霉菌混合菌剂,分装。