[发明专利]一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法

权利要求书

1、一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，其特征是有机的结合了融合PCR技术，酵母高效率感受态制备及转化技术，制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术；

(1)融合PCR技术：

根据融合PCR技术，使用4条引物，使用pfu高保真DNA聚合酶从基因组上PCR得到待敲除基因的左右两臂，再进一步进行融合PCR将左右臂连接起来；

(2)酵母高效率感受态制备及转化技术：

a)挑单菌落接种于5mL YPD培养基中，30℃过夜培养至饱和；

b)0.1％接种至100mL YPD培养基中，30℃培养10h，细胞密度为1×10⁸细胞/mL；

c)培养物分装至两个50mL预冷的无菌离心管中，5000rpm、5min离心去上清，每管加入8mL无菌水重悬，合并成一管；

d)加入2mL pH7.5的10倍TE缓冲液，摇动混匀，加入2mL 1mol·L^-1醋酸锂和0.5mL 1mol·L^-1二硫代苏糖醇，旋转混匀，30℃，50rpm，摇45min；

e)菌悬液稀释至50mL水中，5000rpm、5min沉淀细胞，去上清，重复一次；

f)用适量预冷的1mol·L^-1山梨醇重悬，使最终菌悬液OD＝200；按每份80μL分装于1.5mL离心管中，直接转化或保存于-80℃；

g)将20μL的PCR片段/质粒，与80μL的上述步骤f)所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，冰浴5min；

h)采用电穿孔仪进行电转化：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间为5ms；

i)电击完毕后，加入1mL冰预冷的1mol·L^-1山梨醇溶液将菌体混匀，转移至1.5mL的离心管中；

(3)制霉菌素富集技术及限制性培养基筛选技术：

j)将步骤i)所得菌悬液转入YPD液体培养基中24h后，离心；

k)所得菌体用NFMM洗涤后继续在NFMM中培养6h，用NFMM离心洗涤后，再加入MM培养2h；

l)MM离心洗涤后，分别加入制霉菌素和蔗糖至终浓度10μg·L^-1和170g·L^-1，培养30-120min；

m)将菌体悬液稀释10，100，1000倍分别涂布于LM平板上；

n)将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现；

o)小菌落为可能的营养缺陷型菌株；

p)挑取平板上的小菌落进一步在MM平板相应的SM平板上进行划线分离确认；

q)营养缺陷型菌株进一步用菌落PCR进行验证。

2、根据权利要求1所述的一种无抗性标记营养缺陷型光滑球拟酵母的构建方法，其特征是构建了3种营养缺陷型光滑球拟酵母菌株：分别是精氨酸缺陷型光滑球拟酵母菌株，尿嘧啶缺陷型光滑球拟酵母菌株，精氨酸/尿嘧啶双缺陷型光滑球拟酵母菌株。