[发明专利]一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸生产强度的方法

说明书

技术领域

一株产丙酮酸重组菌的构建及用其提高丙酮酸生产强度的方法，涉及一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸的生产强度，属于辅因子代谢调控策略优化发酵过程技术领域。通过研究辅因子NADH对代谢流流向及相应的代谢通量的影响，实现加强丙酮酸生产强度。

背景技术

丙酮酸又称2-氧代丙酸(2-Oxopropanic acid)、α-酮基丙酸(α-Ketopropionicacid)或乙酰基甲酸(Acetylformic acid)，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。

丙酮酸是生物体的重要中间代谢产物，由于其被广泛应用于化工、制药、农用化学品和营养保健品等行业，因此近年来世界上对其商业需求不断增长。

丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有：酒石酸法、乳酸乙酯空气氧化法、羟基丙酮法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。发酵法生产丙酮酸真正取得突破是1989年日本的研究人员选育出一系列丙酮酸产量超过50g/L的球拟酵母菌株。特别是中国江南大学选育的烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素4种维生素的营养缺陷型T.glabrata CCTCC NO：M202019，是发酵法生产丙酮酸的首选菌株，该菌株已申请中国专利，专利号为ZL 02113142.2。

辅因子工程所涉及到的辅因子主要有：ATP/ADP/AMP、NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺、辅酶A及其衍生物、维生素和微量元素。目前研究主要集中在调节ATP/ADP/AMP、NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺和辅酶A及其衍生物等辅因子在细胞内的形式和含量对代谢途径及代谢流量的影响。

1998年，荷兰Delft大学Hugenholtz J研究小组在乳酸乳球菌(Streptococcuslactis)中过量表达来源于变异链球菌(Streptococcus mutans)编码NADH氧化酶的nox-2基因，导致重组菌葡萄糖代谢速度加快和关键节点碳代谢流重新分布；Heux S等在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，过量表达来源于乳酸菌(Lactococcus lactis)编码产生H₂O-NADH氧化酶的noxE基因，导致胞内NADH和NADH/NAD⁺分别下降5和6倍，而葡萄糖消耗增加10％。

在调控微生物细胞NADH和NAD⁺浓度及其比率对碳代谢组学和通量组学上已开展较多的研究工作。但对调控微生物细胞内NADH/NAD⁺加强目标代谢产物的生产强度的研究，则鲜见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度的方法。通过研究辅因子NADH对代谢流流向及相应的代谢通量的影响，达到加强丙酮酸生产强度的目的。

本发明的技术方案：

一株产丙酮酸重组菌，其分类命名为光滑球拟酵母Pdnox E，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208022。

一种光滑球拟酵母PdnoxE CCTCC NO：M 208022的构建方法，运用分子手段，以乳酸乳球菌NZ 9000基因组为模板，PCR扩增得到目的基因noxE片段，目的基因noxE经限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切消化后，浓缩纯化，将noxE基因定向克隆到表达质粒pYX212中，得到重组酵母表达质粒；将重组酵母表达质粒用电击转化的方法，转入受体菌Torulopsis glabrata CCTCC NO：M202019，在MM培养基中进行筛选，得到NADH氧化酶过量表达的重组菌PdnoxE CCTCC NO：M 208022。NADH氧化酶的过量表达，将NADH氧化途径从大量形成ATP的氧化磷酸化途径转向形成水的NADH氧化酶途径，保证了高酵解速度所需的高NAD⁺水平和低ATP水平。从而解除了NAD⁺浓度不足对糖酵解途径关键酶活性的限制以及减轻了高水平ATP对糖酵解关键酶活性的变构抑制，加强了丙酮酸的生产强度。

一种通过辅因子NADH调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度的方法，采用光滑球拟酵母PdnoxE CCTCC NO：M 208022为出发菌株，经种子培养和液体发酵生产丙酮酸；