[发明专利]酶切天然蚓激酶大分子获取具抗栓活性的小分子片段

说明书

技术领域

生物医药

蚯蚓(地龙)是我国沿用千年之久的传统中药。它主要用于“活血通络”等诸多方面，可治疗中风、痹症、惊厥、炎症等征候，凡四十余种。自上世纪八十年代国外学者从蚯蚓体内发现了具有抗栓溶栓作用的“蚓激酶”以来，世界各国，尤其是中国大力开展了对该类成份的研究和开发。一九九五年“蚓激酶胶囊”作为抗栓新药在我国获准上市。多年来生产厂家和产量不断增加，市场情况良好。

口服蚓激酶虽然具有疗效确切，使用方便、价格低廉、副作用小等优点。但它起效慢，很难用于血栓类疾患的急性期抢救和治疗。而及时治疗对患者的生存和预后是致关重要的，而目前可用的注射用抗栓溶栓生物制剂都存在着某些不足：不是有效时间短(如尿激酶UK)，毒副作用明显(如蛇毒、链激酶SK)，就是价格昂贵(如组织纤溶酶原激活剂tPA)。因此二十年来人们对蚓激酶注射剂的研究和开发始终没有停止过。随着研究的深入，蚓激酶的两大特质凸现无余。首先是蚓激酶在蚯蚓体内的含量很低，仅千分之一左右，杂质的数量和含量都十分巨大。加之它同时存在着性质相近的5~7个同工酶，对分离纯化的干扰很大，造成了纯化步骤多、时间长、活性丢失多，收率低，成本高，以致很难产业化。其次是蚓激酶作为来源于低等动物的大分子异体蛋白，分子量达到30±5kDa(道尔顿)，除有较强的过敏性，抗原性以外，还有明显的降压作用。这些作用给它的应用带来了不利影响。

针对以上问题。有些学者采用基因工程方法，在大肠杆菌及酵母菌细胞中表达获取蚓激酶。结果是收率不高或者活性较低，难以与天然蚓激酶匹敌。

为了解决以上两大难题，简化蚓激酶纯化工艺，提高收率和减轻因分子量偏大引起的上述副反应，本发明采用酶解法对天然的大分子蚓激酶进行分子切割。酶解母液通过超滤，分子筛层析、离子交换，亲和层析，分离得到分子量为15±3kDa(道尔顿)的低分子量蚓激酶活性片段。

该片段在原先用来测定蚓激酶活力的“纤维蛋白平板”上所表现的活力很弱，出现溶圈较快，维持时间较短。提示它已经不是原来的“蚓激酶”了，而是一种分子量较小的，扩散能力较强的，与原酶分子有一定相关性的分子片段。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该片段的分子量为15k±3kDa。证实了上述推断。

该活性片段部分丢失了直接水解纤维蛋白的能力。但经细胞培养试验证实，它具有刺激血管内皮细胞产生内源性“组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)”的能力。在动物试验中可使大鼠优球蛋白溶解时间(ELT)和大鼠颈动脉电击形成血栓时间(OT)明显延长，因而具有体内抗栓、溶栓活性。

实施例1

取蚓激酶粗品10克，用200ml水溶解，加入胃蛋白酶50mg搅匀后置在40℃恒温水浴中水解6小时。

停止水解，向酶解母液中加200ml水进行稀释。用截留分子量为2万Da的超滤膜进行超滤，收集滤过液。再用截留分子量为1万Da的超滤膜进行超滤，收集浓缩液。

浓缩液上葡聚糖凝胶G50柱。以蒸留水洗脱，收集各洗脱峰，用纤维蛋白平板法测定有无溶圈，再将有溶圈活力的洗脱液上DEAE-琼脂糖柱，用磷酸缓冲液进行梯度洗脱，仍收取有溶圈活力的洗脱峰，得活性片段溶液。

(1)取少许上述溶液加蔗糖制成电泳样品液，以低分子量标准蛋白作对照品，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示单一谱带。其Rf值靠近分子量为14.4kDa的溶菌酶。估算分子量在15±3kDa区间。

(2)再将活性片段溶液50μl作用于人工培养的人胚胎脐静脉内皮细胞，经过24小时孵育，分离出培养液，用上海太阳生技公司出品的tPA检测药盒，测定细胞培养液中的tPA含量，数据如下

*为细胞培养液中的本底浓度。

实施例2

取冰冻的鲜蚯蚓500克，加水500ml用匀浆机打成匀浆，在15℃下提取6小时。该提取液在每分钟4000转下离心分离20分钟，获取上层液。该粗酶液在40℃下自行水解8小时。再如上法离心除去沉淀，获浅黄色透明酶解液。

然后如同实施例1，分别用截留分子量为2万Da和1万Da的超滤膜进行酶解液的超过滤，获取浓缩液，再经葡聚糖凝胶柱和DEAE-琼脂糖离子交换柱进行层析。收集有微弱溶圈活力的洗脱液，进行大鼠颈动脉电击血栓形成抑制试验。结果如下：

说明该活性片段有明显的抑制血栓形成的能力。