[发明专利]一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，涉及一种农药代谢物残留检测方法，更具体的说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测纺织品原料棉花中的甲基对氧磷的残留，属于免疫分析技术领域。

背景技术

上世纪60年代以来的研究进一步发现，除了农药本身以外，它的代谢产物也会出现残留毒性问题，且毒性比农药母体还要强。这一发现不仅促使加强了对农药残留降解的研究，还引发了对农药降解过程中代谢产物毒性的研究。甲基对硫磷(M 1605)是常见的有机磷农药，而甲基对氧磷(M 1600)为其代谢产物。甲基对氧磷的毒性，比原母体甲基对硫磷毒性更大。甲基对硫磷在喷洒作物上消失很快，在短期内，少量的甲基对硫磷已转变为甲基对氧磷而增加毒性。因而检测甲基对氧磷的残留成为一种必要，而且还可以作为甲基对硫磷的接触生物标志物。

甲基对硫磷(Parathion-methyl)    甲基对氧磷(Paraoxon-methyl)

既往甲基对氧磷检测多用液相色谱法，仪器昂贵，纯化费时，且需要专门人员操作。酶联免疫吸附测定法(ELISA)提供了一种痕量甲基对氧磷检测的快速、灵敏、选择性的检测方法。张卫国，马兆扬合成了甲基对氧磷的人工抗原并进行了鉴定，得到了较好的多克隆抗体。但只对抗体的效价、特异性进行了测定。目前还缺少对实际样本中的甲基对氧磷残留检测建立ELISA方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，是一种快速检测纺织品中甲基对氧磷农药代谢物残留的免疫学检测方法，使样品无需经过繁琐的提纯或浓缩步骤，并且保证较高的敏感性和特异性。

本发明的技术方案：利用尹丽梅、胥传来、袁媛等(一种二甲氧基磷酸酯类农药通用半抗原的合成方法[P].中国专利：CN101172984A)合成的O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯为半抗原，此半抗原与BSA偶联作为免疫原免疫健康新西兰大白兔得到多克隆抗体，半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了纺织品中甲基对氧磷农药残留的间接竞争酶联免疫方法。

一种甲基对氧磷的酶联免疫检测方法，步骤如下：

(1)抗原的包被

以半抗原O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯与卵清蛋白OVA的偶联复合物作为包被抗原，以0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1∶32000～1∶64000，浓度为0.625～1.25μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；

(2)竞争反应

将免疫制备的甲基对氧磷多克隆抗体用抗体稀释液：含0.1％明胶、含0.05％吐温-20、pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1∶2000～1∶4000比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，同时每孔分别加入标准品稀释液PBST稀释的0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL系列浓度之一的甲基对氧磷标准品50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)加酶标二抗

加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液稀释为1∶5000，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)显色

每孔加入100μL显色液，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL、2mol/L的硫酸终止液，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀，与所作的标准曲线对比算出待测样品的甲基对氧磷浓度。

显色液配方：A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂用超纯水定容至100mL；B液：60mg 3，3^/，5，5^/-四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5∶1体积混合。

标准品稀释液PBST为含0.15mol/LNaCl、含0.5％Tween-20的0.01mol/L、pH 7.4PBST溶液。

1、主要溶液配制：

1)配制0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)：

Na₂HPO₄.12H₂O     3.62g，