[发明专利]一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

邻苯二甲酸二异辛酯(Diethylhexyl phthalate，DEHP)是酞酸酯的一种。酞酸酯作为增塑剂在塑料的加工生产中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生产中被广泛的使用。由于酞酸酯增塑剂与塑料基质之间没有形成共价键，而是以氢键和范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质，因而在接触到包装食品中所含的水、油脂时，便会溶出。经过研究发现酞酸酯是一种环境激素物质，它干扰生物为保持体内平衡并调节生长过程的正常激素的产生、释放、转移、代谢、反应和消除，或在未受损的生物后代中引起不良的健康影响和内分泌功能的改变。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(又称邻苯二甲酸二异辛酯，di-2-ethylhexylphthalate，DEHP)是邻苯二甲酸酯类增塑剂中用量最大的一种，应用广泛，在塑料中的含量可达60％。目前，国内外有关邻苯二甲酸二异辛酯的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，国内外已经开展了对酞酸酯类免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对邻苯二甲酸二异辛酯的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要制备邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法，所制备的产品可用于邻苯二甲酸二异辛酯免疫分析方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。

本发明的技术方案：一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测，以4-硝基邻苯二甲酸为原料，在浓硫酸的催化下与异辛醇发生酯化反应，然后利用铁粉还原法使4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯苯环上的硝基还原为胺基，制备人工半抗原；第二步为人工抗原的制备及检测，利用重氮化法对半抗原上的胺基进行重氮化并使之与牛血清蛋白结合，制备邻苯二甲酸二异辛酯的人工抗原，即邻苯二甲酸二异辛酯-牛血清蛋白。

其反应方程式为：

工艺步骤为：

(1)人工半抗原的制备：

①4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯的合成

称取0.12mol的4-硝基邻苯二甲酸于100mL的三颈烧瓶中，加入0.1mol即15.74mL的异辛醇，加入一定量的苯助溶，在搅拌的条件下，缓慢加入1.6mL的浓硫酸，加热升温至110-130℃，反应7-24h，减压蒸去有机溶剂，油状残留加入到冷水中用质量浓度10％的Na₂CO₃溶液洗至下层水层无色，取上层得到暗红色的油状粗品，用无水乙醇进行重结晶，得到43mmol的4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯。

硅胶薄层板的制作：称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用。

薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.76处观察到显色点作为反应终点。

②4-氨基邻苯二甲酸二异辛酯的合成

称取9mmol还原铁粉于50mL圆底烧瓶中，加入10mL水、3mmol氯化铵，水浴中加热15min。另称取4-硝基邻苯二甲酸二异辛酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反应液当中，回流反应4-6h。趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到的橙红色残留用少量热甲醇溶液溶解，4℃析出1.06g橘红色油状液体的4-氨基邻苯二甲酸二异辛酯作为半抗原备用。

薄层层析法检测：硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为乙酸∶正己烷体积比为1∶15，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.52处观察到显色点作为反应终点。

(2)人工抗原的制备：