[发明专利]表达harpin蛋白的重组载体pM43HF及其工程菌

权利要求书

1.表达harpin蛋白的重组载体pM43HF，其特征在于，是通过以下方法构建而成的：

1)Harpin蛋白酵母表达载体pPICZHP构建：以登录号为GenBank AY875714的harpin蛋白编码基因hrf2为模板，设计引物P1和P2，

P1  CCGAATTCATGAACTCTTTGAACACACA    EcoRI

P2  TCTAGAATCTGCATTGATGCGCTGTCG     XbaI

PCR扩增条件为：95℃，4min；94℃，45s；57℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min，扩增片段大小为427bp，将纯化的片段用EcoR I和Xba I双酶切，克隆到酵母表达载体pPICZaA相同的酶切位点，得到了Harpin蛋白酵母表达载体pPICZHP；

2)大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pMA5HF的构建：以Harpin蛋白酵母表达载体pPICZHP为模板，设计引物P3和P4，

P3  CATATGAACTCTTTGAACACACAATTC      NdeI

P4  AAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGGTC   Hind III

扩增的条件为：95℃，4min；94℃，45s；58℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min；扩增的基因片段大小为492bp，将扩增的片段用Nde I和Hind III双酶切后，克隆到载体pMA5相应的酶切位点，得到了大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pMA5HF；

3)中间载体pMD18P43SP的构建

(1)以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，用引物P5和P6扩增登录号为GenBankK02174的P43启动子片段，扩增的程序为：95℃，4min；94℃，45s；62℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min；扩增的片段大小为335bp；

P5  GGTTTAAAGGTGGAGATTTGATAGGTGGTATGTTT

P6  CTTGGTCAAGTTGCGCATGTGTACATTCCTCTCTT

(2)以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，用引物P7和引物P8扩增登录号为GenBankM62845的nprB信号肽编码基因序列，扩增的程序为：95℃，4min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，45s；30个循环；72℃，10min；扩增获得的nprB信号肽编码基因片段大小为112bp；

P7  AAGAGAGGAATGTACACATGCGCAACTTGACCAAG

P8  CATATGTGCTGCAGCTGAGGCATGTGTT    Nde I

(3)以上述扩增获得的P43片段和nprB信号肽编码序列片段为模板，用引物P5和P8，采用重迭PCR方法将两种组件融合，得到P43+nprB片段，该融合片段的大小为412bp，扩增的程序为95℃，4min；94℃，45s；60℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min；

(4)以载体pMA5为模板，设计引物为P9和P10，扩增包含ble编码基因GenBankM19465的片段，扩增程序为：95℃，4min；94℃，45s；61℃，45s；72℃，1min；30个循环；72℃，10min；扩增的ble编码基因片段大小为815bp；

P9   GGCGTACGTATTTATTAACTTCTCCTAG         SnaB I

P10  AAACATACCACCTATCAAATCTCCACCTTTAAACC 

(5)以上述扩增获得的P43+nprB和ble片段为模板，引物为P9和P8，再次采用重迭PCR方法将两个片段融合，扩增的程序为：5℃，4min；94℃，45s；61℃，45s；72℃，1.3min；30个循环；72℃，10min；得到的ble+P43+nprB片段的大小为：1194bp；然后将纯化的ble+P43+nprB片段进行TA克隆反应，将片段克隆到测序载体pMD18T，测序正确后，得到了重组载体pMD18P43SP；

4)枯草芽孢杆菌Harpin蛋白表达载体pM43HF的构建

为了将载体pMA5的HpaII启动子替换为P43启动子和nprB信号肽编码序列，用SnaBI和Nde I对pMD18P43SP进行双酶切，回收得到的ble+P43+nprB片段克隆到pMA5HF相应的酶切位点，得到了重组载体pM43HF。