[发明专利]杂草稻红色果皮基因的分子标记

说明书

技术领域

本发明提供了杂草稻红色果皮的分子标记鉴定方法，属于分子遗传学领域，专用于杂草稻的红色果皮基因型的分子鉴定。

技术背景

水稻亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，为世界上近一半的人口提供粮食。但是，现在水稻的生产受到越来越严重的杂草危害，尤其是与它同属于一个生物物种的杂草稻(Oryza sativa L.f spontaneous)。杂草稻是广泛分布在世界各地稻田中的一种恶性杂草，能降低水稻的产量和质量。因其果皮常为红色，杂草稻也被称为红米稻(Red rice)。由于杂草稻与栽培稻的亲缘关系很近，杂草稻比稻田中的其它杂草更难防除。

由于水资源和农村劳动力的缺乏，包括中国在内的许多国家的水稻栽培方式都正在从传统的移栽方式向省水省劳动力的直播方式转变，杂草的管理方式从精细向粗放转变，这些耕作方式和管理方式的改变为杂草稻的生长和扩散提供了有利的条件。因此，近年来，杂草稻给世界各地的水稻生产造成了越来越严重的影响，在中国东北和江苏地区也频繁的发现杂草稻，并迅速扩散，治理杂草稻成为刻不容缓的事情。

杂草稻是直播稻田水稻生产主要危害因素，在苗期其形态特征与栽培稻完全一致，难以早期发现，杂草稻生命力旺盛，分蘖力强，与栽培稻竞争营养，多数抽穗早，落粒性强，对水稻生产造成危害，同时少量的杂草稻种子混入栽培稻，一方面影响稻米外观品质，另一方面可以随种子运输，加剧杂草稻的流行和泛滥，给水稻生产造成更为严重的危害。因此，急需建立可以对杂草稻基因型进行鉴定的技术体系，一方面对直播稻田中杂草稻进行早期鉴定，另一方面可以对杂草稻危害的预测预报提供依据。

世界各国发现的杂草稻决大多数是红色果皮，红色果皮是杂草稻的基本特征之一，而决大多数栽培稻是白色果皮，因此杂草稻区别于栽培稻的重要特征是果皮颜色，而果皮颜色只有在种子成熟以后才能观察到，为此本研究开发了可以对果皮颜色进行基因型鉴定的共显性分子标记，为建立杂草稻鉴定的技术体系奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是：提供江淮流域杂草稻鉴别的分子标记方法，利用本研究开发的基于PCR的实用经济型标记，可以有效地从栽培稻中鉴定出红米杂草稻，为杂草稻的鉴别提供分子证据。

本发明所提供的可鉴别杂草稻和栽培稻的InDe1标记RID14，是通过以下方法获得的：

1)在江苏收集到目前在水稻直播稻田危害生产的杂草稻，其颖壳为草黄色，其果皮为红色，也称为“红米稻”。将收集到材料与广亲和粳稻品种02428配组正反交杂交组合F₁。杂草稻作母本，其杂种的果皮颜色为红色，以02428作母本，其杂种果皮颜色为白色，收获正反交F₁所结F₂种子果皮颜色都为红色，F₂所结F₃种子果皮颜色分离，红色果皮：白色果皮分离比例符合3：1，说明控制杂草稻红色果皮基因为显性单基因控制，并由母体基因型决定。

2)普通野生稻(0.rufipogon L.)是栽培稻(0.sativa L.)的祖先，普通野生稻的果皮为红色，控制其果皮颜色的基因Rc已经克隆(2006，Plant Cell)。Rc编码b-HLH型转录因子，正调控原花色素(Proanthocyanidin)的合成，其等位基因rc在第6外显子存在14bp的缺失，导致翻译提前终止。我们根据这14bp缺失设计了InDe1标记，

InDe1标记RID14引物序列如下：

上游引物：5′TCCAGGCACCACACAGAGA　　3′

下游引物：5′GGCACTGAAATCACCTTGG　　3′

对普通野生稻(红色果皮)的基因组DNA扩增产物为154bp，而栽培稻(白色果皮)的基因组DNA扩增产物为140bp。通过对杂草稻PCR产物测序证实，控制杂草稻的红色果皮基因与普通野生稻一致。

3)利用SDS方法提取02428与杂草稻的F₂群体各单株的DNA，利用InDe1标记RID14引物进行PCR，扩增产物在8％聚丙烯酰胺进行电泳或者3.5％的琼脂糖电泳分析，我们发现该标记与红色果皮共分离。即该标记是共显性标记，能对果皮颜色的纯合基因型和杂合基因型进行准确鉴定，标记基因型为RcRc，Rcrc的单珠，其果皮颜色为红色，标记基因型为rcrc的单珠，其果皮颜色为白色。标记基因型RcRc：Rcrc：rcrc符合1：2：1的比例(图1)。