[发明专利]一种提高2－酮基－L－古龙酸发酵生产稳定性的方法

说明书

技术领域

一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产稳定性的方法，属于生物工程技术领域。2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，KGA)又称维生素C，简写为KGA，本发明涉及一种维生素C发酵的关键影响因素。通过研究微量元素液(金属离子、维生素、氨基酸)对维生素C发酵的影响，得到维生素C发酵最显著的影响因素。

背景技术

维生素C，又称抗坏血酸，作为人体必需的一种维生素和抗氧化剂，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中。

随着维生素C应用范围的不断扩大，维生素C的市场需求量也在不断的增长。最早实现维生素C工业化生产的工艺是德国Reichstein于1934年发明的五步化学反应和一步生物转化，先将葡萄糖转化为2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-Gulonic acid，2-KGA)，再经酯化生成维生素C。但该法存在能耗高、消耗大量有机溶剂、环境污染严重等缺点。因此需要开发更经济、更具有竞争力的生物转化法或完全生物转化法。与“莱氏法”生产维生素C的六步化学反应相比，用微生物从D-山梨醇或D-葡萄糖经两步发酵生成2-KGA，再经甲醇酯化生产维生素C的生物技术法具有工艺流程简单、生产周期短、成本低廉，环境友好等优点。

玉米浆是玉米淀粉等产品加工过程中的浸泡水经浓缩至含固形物70％左右后得到的副产品，其构成成分较复杂，其中蛋白质含量高达40％以上(按干基计)，氨基酸、生物素和维生素(如烟酸等)含量较丰富。玉米浆作为一种较好的微生物生长或代谢产物合成的促进剂已广泛应用于酶制剂、抗生素、生化药物等众多发酵产品的生产过程。在维生素C发酵过程中，玉米浆批次之间的差异会造成2-KGA的产量和发酵周期不稳定。确定菌体生长和产酸需要的特殊生长因子是控制2-KGA生产稳定性的先决条件。

发明内容

本发明的目的是得到一种维生素C发酵的关键影响因素。检测玉米浆中的主要微量元素(金属离子、维生素、氨基酸)，并利用微量元素混合液代替玉米浆进行维生素C发酵，研究维生素C发酵的关键影响因素。

本发明的技术方案：一种提高2-酮基-L-古龙酸KGA发酵生产稳定性的方法，2-酮基-L-古龙酸又称维生素C，确定维生素C发酵的关键影响因素，采用正交试验来考察金属离子混合液、氨基酸混合液及维生素混合液在维生素C发酵中的作用；在得出金属离子混合液是细胞生长、KGA合成和L-山梨糖消耗的显著影响因素的基础上，进一步采用正交试验考察各种金属离子对维生素C发酵的影响；发现，增加Mg²⁺浓度能促进KGA合成，是维生素C发酵的显著影响因素；

利用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)IFO 3293和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC 21916为生产菌株；

优选后确定的发酵培养基以g/L计：山梨糖80，尿素12，碳酸钙5，玉米浆粉5，用硫酸镁或氯化镁调节Mg²⁺浓度达到0.17g，磷酸二氢钾1；pH 6.7-7.0；

摇瓶培养条件：将30℃、200rpm下培养18h的混菌种子以10％的接种量转入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养72h。

采用优化组合进行维生素C发酵的KGA产量和产率分别为75.2g/L和0.94g/g，与普通培养基相比，KGA产量(67g/L)和产率(0.84g/g)分别提高了12.24％和11.9％。

1、菌株：巨大芽孢杆菌ATCC 21916(Bacillus megaterium，俗称大菌)、氧化葡萄糖酸杆菌IFO 3293(Gluconobacter oxydans，俗称小菌)，购自美国典型微生物菌种保藏中心。两种菌株进行混合种子培养，即为混菌种子。

2、培养基

种子和斜面培养基(g/L)：山梨糖20，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，玉米浆粉0.15，尿素1，碳酸钙1，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1；琼脂20(斜面培养基)，pH 6.7-7.0。

优选试验所用发酵培养基(g/L)：山梨糖80，尿素12，碳酸钙5，硫酸镁0.1，磷酸二氢钾1，微量液根据实验要求添加；pH 6.7-7.0。

所述微量液：由金属离子混合液，维生素混合液及氨基酸混合液根据实验要求组成。