[发明专利]一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光PCR检测方法

权利要求书

1.一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光PCR检测方法，其特征是包括免疫原、 包被原、和抗体的制备，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联， 金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，包被原的固定，流动注射系统中的免 疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光PCR的检测：

(1)免疫原的制备：将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；

①取0.25mL溶解有微囊藻毒素-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水， 加入150μL的碳二亚胺，得A液；

②用1mL 25％的乙醇溶液溶解2mg的牛血清蛋白BSA，得B液；

③将A液逐滴加入到B液中，再加入150μL的碳二亚胺，混匀，4℃反应12h， 得到微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液；

④将微囊藻毒素-LR-BSA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子 水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原： 微囊藻毒素-LR-BSA，作为免疫原；

(2)包被原的制备：将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；

①取微囊藻毒素-LR 0.5mg溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得C液；

②取三正丁胺15μL溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得D液；

③将D液加入到C液中；

④取氯甲酸异丁酯12μL，溶于500μL N，N-二甲基甲酰胺中，4℃搅拌下逐 滴加入到C液中，反应1h；

⑤取卵清蛋白OVA 6mg溶于3mL pH 9.0、50mmol/L的碳酸钠溶液中，将上 述④反应液于18℃搅拌下逐滴加入到卵清蛋白溶液中，室温反应12h，即得到微 囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液；

⑥将微囊藻毒素-LR-OVA偶联物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去离子 水透析4-6天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原： 微囊藻毒素-LR-OVA，作为包被原；

(3)抗体的制备：将免疫源用常规方法制备特异性多克隆抗体；

(4)磁性纳米粒子的修饰：将制备的Fe₃O₄种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；

用二次蒸馏水分别配制FeSO₄·7H₂O和FeCl₃·6H₂O的溶液及氢氧化钠溶液， 将所配两种铁盐溶液混合，在铁盐的混合溶液中Fe²⁺离子的浓度为0.12mol/L， Fe³⁺的浓度为0.2mol/L；氢氧化钠溶液的浓度为2.5mol/L；在剧烈搅拌下将一 定体积的氢氧化钠溶液缓慢滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60℃陈化 2小时，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在60℃干燥24小时，在玛 瑙研钵中研磨后所得产物为Fe₃O₄种子；将所得Fe₃O₄种子0.125g用100mL乙 醇和1mL水溶解，超声30min，滴加0.4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，室 温搅拌7小时，以8000r/min离心30min，将APTES修饰的Fe₃O₄纳米颗粒从反 应介质中分离，并用乙醇溶液对其清洗5次，过滤后再在60℃干燥24小时，备 用；

(5)磁性纳米粒子与包被原的偶联：

取所得APTES修饰的Fe₃O₄纳米颗粒10mg，N-羟基琥珀酰亚胺NHS 11.5mg， N，N-二环已基碳二亚胺DCC 20.63mg，加入到3mL N，N-二羟基甲酰胺中，室温 搅拌反应过夜，离心去沉淀，上清液再与3mL含60mg卵清蛋白OVA的溶液在4℃ 下搅拌反应过夜，离心，上清液用超纯水透析3天，对透析袋中溶液进行磁性分 离，弃上清，加入含2％明胶的封闭液封闭，再加入PBST洗涤液，洗涤后磁分离， 去上清，最后向磁性分离过的离心管中加入1mL 0.02mol/L pH 7.6的Tris缓冲液， 4℃保存备用；

(6)两种粒径的金纳米粒子制备；

制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸，加热， 煮沸，紧接着加入1％的柠檬酸三钠溶液3.5mL或1mL，边加热边搅拌，溶液颜 色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟柠檬酸三钠使金纳米粒子完全沉降，所 得金纳米粒子粒径对应分别为13nm或30nm，最后，溶液分别冷却至室温，稀释 到100mL，4℃保藏；

(7)两种金纳米探针的制备；

30nm金纳米探针的制备：首先，30nm金纳米粒子与1.5μg的羊抗兔在pH 9.1 碱性水溶液中搅拌反应，紧接着，向溶液中加入巯基修饰的寡核苷酸 5’-TACGAGTTGA GACCGTTAAG ACGAGGCAAT CATGCAATCC TGAATGCGTT TTTTTTTT-SH-3’，室温反应20个小时，再用含0.1M氯化钠的 10mM的磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时后于-4℃下2000r.p.m离心 30分钟，弃上清；红色沉淀物用含0.1M氯化钠10mM的磷酸盐缓冲溶液溶解， 加入1.5μM的目标探针5’-CGCATTCAGG ATTGCATGAA TGCCTCGTCT TAACGGTCTC AACTCGTA-3’37℃杂交4小时，再次离心去上清，杂交过程重 复4次，沉淀最后溶解于含0.3M氯化钠的10mM磷酸盐缓冲溶液中，得到羊抗兔 抗体及双链DNA共同修饰的30nm金纳米探针，作为储备液4℃保藏；

13nm金纳米探针的制备：直接向13nm金纳米溶液中加入巯基寡核苷酸 5’-GGCAATCATG CAATCCTGAA TGCGAAAAAAAAAA-SH-3’，室温反应20 小时，再用含0.1M氯化钠的10mM磷酸盐缓冲溶液调节pH值至7.0，盐陈40小时 后于-4℃下2000r.p.m离心30分钟，弃上清；红色沉淀物用含0.1M氯化钠的10mM 磷酸盐缓冲溶液溶解，4℃保藏；

(8)包被原固定及流动注射系统中的免疫反应：先用pH7.0、含0.1M氯化钠 的0.01M磷酸盐缓冲液作洗液清洗微管和免疫反应池，然后将40μL 0.5mg/mL抗 原修饰的超顺磁纳米粒子溶液吸入螺线管中，再以5μL/s的速率注入免疫反应池 内，电磁铁通电，吸附磁珠，将其固定在反应池内；将预孵育的50μL抗体和50μL 微囊藻毒素-LR混合溶液吸入螺线管中，其中，微囊藻毒素-LR溶解于pH 7.4含 0.05％Tween-20的0.01M PBST中，浓度从1pg/mL～100pg/mL；然后，将混合溶 液注入免疫反应池中室温反应10分钟，再以20μL/s的速度注入400μL pH 7.0、含 0.1M氯化钠的0.01M PBS洗液；之后，将100μL的羊抗兔抗体及双链DNA共同 修饰的30nm金探针的溶液以1μL/s的速度注入反应池，反应6分钟，冲洗；以2μL/s 的速度注入100μL的双蒸水，60℃反应6分钟，最后再注入100μL的双蒸水，收集 所需单链DNA，撤去磁场，洗涤柱子以备再用；

(9)流动注射荧光PCR的检测：利用间接竞争免疫检测将微囊藻毒素-LR和 多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体及双 链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集得到 的单链DNA进行实时荧光定量PCR检测，得到关于微囊藻毒素-LR的浓度与Ct 值的标准曲线；

设计正义引物F为：5’-cgcattcaggattgcatga-3’，反义引物R为 5’-cgagttgagaccgttaagacga-3’；其次，配制总体积为20μL的反应溶液，各组分分 别为：TOYOBO SYBR Green Real-time PCR Master Mix10.0μL；超纯水6.8μL； 正义引物F 0.6μL；反义引物R 0.6μL；所收集的单链DNA 2.0μL；将此混合溶液 放入实时荧光PCR仪，进行如下操作：95℃/30s预变性；进行扩增， 95℃/5s，60℃/5s，72℃/10s，共45个循环；进行熔点曲线分析：95℃/0s，45℃/15s， 95℃/0s，0.1℃/s连续收集荧光，1个循环；最终得到关于微囊藻毒素-LR的浓度 与Ct值的标准曲线；

待测样品测得的Ct值与得到的标准曲线进行比对，得到待测样品中微囊藻 毒素-LR的含量。