[发明专利]一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法

权利要求书

1.一种用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物，其特征是：所述液相芯片是由特异性检测探针与荧光微球偶联形成的特异性检测微球，所述特异性检测探针是在5’端加上C₁₂分子臂和氨基修饰的特异性探针，所述特异性探针为：

FluA-probe TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA

H5-probe CCGCAGTATTCAGAAGAAGC

N1-probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC

FluB-probe GCCATAGGAAATTGCCCAAT；

所述特异性检测引物是对所有反向引物进行生物素标记的简并引物，所述简并引物为：

FluA-Forward GAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTAT

FluA-Reverse GGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCAT

H5-Forward GGTAACGGTTGTTTCGARTTCTATCA

H5-Reverse ATAGACCAGCYACCATGATTGCCAG

N1-Forward GGACYAGTGGGAGCAGCATA

N1-Reverse TGTCAATGGTRAAYGGCAACTC

FluB-Forward AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA

FluB-Reverse CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA。

2.根据权利要求1所述的用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、设计引物和探针，依据现有核酸数据库中甲型流感病毒H5、N1和NP的基因节段序列以及乙型流感病毒中的HA基因节段序列进行同源性比对，根据保守序列，设计针对各基因的简并引物和特异性探针；所述简并引物和特异性探针如权利要求1所述；

步骤二、合成及修饰引物和探针，在设计完成的特异性探针的5’端加上C₁₂分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针；对设计完成的简并引物中的所有反向引物进行生物素标记，得到特异性检测引物；

步骤三、制备液相芯片，将所述特异性检测探针与荧光微球偶联形成特异性检测微球，即液相芯片。

3.根据权利要求2所述的用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物的制备方法，其特征在于：所述步骤三中特异性检测探针与荧光微球偶联形成液相芯片的步骤是将特异性检测探针稀释至1mM，重悬微球，取80μl数目为1×10⁶个的羧基微球，离心后弃上清，加入0.1M、pH＝4.5的MES 10μl，混匀，在反应体系中加入0.04～0.1nmol的特异性检测探针，混匀，然后加入10mg/ml EDC1.25～2.5μl，混匀，室温避光孵育30min后，用0.5ml体积分数为0.02％的Tween-20和0.5ml质量浓度为0.1％的SDS各洗涤一次，最后用80μl TE缓冲液重悬微球，血细胞计数器计数后混合4种微球，用TE缓冲液稀释后4℃避光保存，备用。

4.根据权利要求3所述的用于检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的液相芯片和特异性检测引物的制备方法，其特征在于：在反应体系中重复加入EDC，室温避光孵育30min。