[发明专利]一种温度两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶的方法

说明书

技术领域

一种温度两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶的方法，涉及环境因素(温度、pH)分阶段控制策略在发酵过程优化中的应用技术领域。

背景技术

角质酶(Cutinase)是一种多功能酶，属丝氨酸酯酶的一种，相对分子质量约为22～30kD，是一种具有称作α/β水解酶折叠的共同结构框架的蛋白质，既可水解不溶性多聚体角质，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯等。除了水解反应外，角质酶还能参与酯化、转酯化等反应。因此其在纺织业、食品工业以及生物催化、化工工业等诸多领域有着广泛的应用前景，特别是在纺织工业的应用是近几年开发的新领域，它是继碱性果胶酶之后的另一种主要新型纺织品清洁生产的酶制剂。其同样可以作为棉织物生物精练处理过程中重要的酶制剂，其研制及在棉针织物精练中的应用，使另一种全新温和的绿色精练方式成为可能。角质酶在生物精练处理过程中，能有效分解棉纤维表面疏水性的角质和腊酯，使疏水性物质从棉纤维表面脱落，从而达到精练效果，而纤维本身不受到损伤，如果角质酶和碱性果胶酶混合使用处理棉纤维则效果更佳。因此，经生物精练的棉纤维能最大程度的保持纤维强度，失重小，织物手感柔软厚实，且富有弹性，并且克服了传统碱精练过程中棉纤维损失较大，强度损伤严重及环境污染严重等缺点。

角质酶虽然有很广泛的应用前景，但国内外迄今为止并没有工业化生产角质酶的成功实例，角质酶市场仍处于空白。本实验室通过基因手段构建的产F.solani pisi角质酶工程菌是以Bacillus subtilis作为宿主，此菌种表达量较高，通过在摇瓶发酵条件优化以及在3L发酵罐上发酵条件的优化，确定了发酵工艺，为实现工业化生产奠定基础并且填补国际角质酶工业化生产空白，同时带来极高经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基于pH分阶段控制的温度两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶的方法，本发明的优点在于工艺简单易行，能有效地提高角质酶的产量及生产强度。

本发明的技术方案：

菌种：重组芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSHB 06-07为出发菌株，该菌株已在【中国生物工程杂志China Biotechnology，2008，28(5)：59～64】公开。

菌体保持培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，甘油50％(v/v)。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨12，酵母膏24，磷酸氢二钠12.54，磷酸二氢钾2.31，pH 7.5。

发酵培养基(g/L)：蔗糖32.5，蛋白胨37，酵母膏24，磷酸氢二钠12.54，磷酸二氢钾2.31，七水硫酸镁4.4，pH 7.5。

培养方法：将保藏好的菌种接入种子培养基中，500mL三角瓶装50mL培养基，回转式摇床转速200r/min，37℃，培养14～16h。将培养好的种子以4％接种量接入到3L全自动发酵罐KBT(KoBio Tech Co.，Ltd.，韩国)中，装液量1L；两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶：菌体生长阶段：控制温度为37℃、pH 7.5、搅拌转速600r/min、通气量为1.5vvm直到菌体OD₆₀₀达到12.65；高效表达阶段：当菌体OD₆₀₀达到12.65，菌体生长进入对数生长期后，将发酵温度降到30℃、pH 6.5、搅拌转速600r/min、通气量为1.5vvm，直到发酵结束。

角质酶活性测定：取稀释适当倍数的样品900μL，加入100μL 2mol/L的NaOH溶液，混匀后于沸水浴中反应10min，立即用流动冷水冷却至室温，再向其中加入1mL间苯二酚和3mL 10mol/L的HCl，混匀后于沸水浴中反应8min，立即用流动冷水冷却至室温，然后用分光光度计测定其500nm处的吸光度。

本发明的有益效果：利用本发明能大幅提高角质酶的产量及生产强度，产量由170U/mL提高到312U/mL，生产强度由11.74U/mL/h提高到13.2U/mL/h，并能够减少发酵液中杂蛋白的含量，提高了产品纯度和下游提取时的效率，并且减少了能耗，有利于工业化大规模生产，弥补了角质酶工业化生产的空白，推动了角质酶在棉纺织业的应用，从而促进纺织工业的发展。

本发明采用基于pH分阶段控制策略的温度两阶段控制策略在3L罐上发酵达到先进水平，并且对其它的重组菌的发酵具有一定的指导意义。

具体实施方式