[发明专利]填补昆虫基因组物理图谱中裂缝的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种昆虫的基因组DNA，特别涉及一种用电子克隆技术填补昆虫基因组物理图谱中未知序列的方法。

背景技术

2006年10月26日，来自13个国家数十个科研机构的将近200名科学家组成的蜜蜂基因组测序联盟，在《自然》上公布了他们对西方蜜蜂的全基因组的测序和分析结果。该研究团组用4年的时间，测定了这个拥有约2.36亿个碱基对的蜜蜂基因组，鉴定了10000多个基因。在蜜蜂基因组测序的基础上，研究人员对蜜蜂所拥有的基因进行了注释，开展重要功能基因的基础和应用研究。他们认为，蜜蜂的全基因组密码的破译，不仅揭示了蜜蜂进化的奥秘，也带来与农业生产、人类健康有关的重要信息。这一成果虽然令人振奋，但蜜蜂全基因组图谱中还存在大量的裂缝(Gap)，裂缝中的碱基序列至今不明，短的裂缝有数10bp，长的达1000bp以上，这些未知序列的存在无疑是基因组计划中的缺憾，一些正值外显子区域的裂缝对解读蜜蜂基因密码带来很大障碍。本发明作出之前，在“扩增未知序列DNA片段的PCR技术研究进展”[生物工程进展2001.Vol 21.N0 1 51-57]一文中，介绍了多种扩增未知序列的方法，如同端化PCR(UT-PCR)、反转录PCR(RT-PCR)等，但这些方法耗时长、费用高、操作复杂。

然而，随着蜜蜂等昆虫EST数据库的日臻完善，电子克隆技术为扩增未知序列、填补基因组图谱裂缝及寻找昆虫新基因提供了技术支撑。为进一步完善昆虫基因组数据库、有效解读其基因密码、描绘昆虫基因组精细图谱提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种准确有效地填补昆虫基因组物理图谱中裂缝的方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种填补昆虫基因组物理图谱中裂缝的方法，包括：

(1)将昆虫基因组中未知序列的上游或下游200～500bp的碱基序列作为信息探针，到NCBI网站的昆虫EST数据库中进行相似性检索；

(2)检索得到的相似性高于95％的EST序列回到该昆虫EST数据库中进行再检索，将检索得到的片段用DNASTAR软件进行拼接，形成的片段回到EST数据库中继续检索，

(3)重复步骤(2)，直至检出所有的重叠EST或重叠群不能继续延续为止；

(4)用DNASTAR软件将检索得到的所有EST序列拼接成一条完整的重叠群片段；

(5)将上述拼接得到的完整的重叠群片段与裂缝中未知序列进行相似性比对，检验所获片段序列的填补效果；

(6)根据所获重叠群片段的序列，设计特异引物；

(7)提取该昆虫的基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，通过PCR产物的测序分析，进一步验证裂缝中碱基序列的准确性，完成裂缝未知序列的填补。

所述的昆虫为蜜蜂或家蚕。

本发明以昆虫基因组序列中未知序列(裂缝)侧翼的一段已知序列为信息探针，以EST数据库为介质，采用电子克隆技术对裂缝中的未知序列进行搜索和拼接，并用PCR方法对裂缝序列进行测序和验证，与现有技术相比，具有简便、快捷和准确的优点，它有效地填补了昆虫基因组物理图谱中残存的裂缝，为进一步完善昆虫基因组数据库、描绘基因组精细图谱、有效解读基因密码提供科学依据。

附图说明

附图1为本发明技术方案的流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：

本实施例技术方案用以填补蜜蜂基因组物理图谱中裂缝，具体步骤如下：

参见附图1，先搜索并下载蜜蜂基因组序列，裂缝位于蜜蜂16号染色体的NW_001253149片段中，其特征是由151个N代替染色体碱基序列上的A、T、C、G四种碱基，从60560位至60710位定名为1号裂缝，长度为151bp。

在网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载蜜蜂16号染色体序列(序列编号：NW_001253149)，找到1号裂缝位置，以裂缝右侧480bp碱基为信息探针。

用信息探针在蜜蜂EST数据库中检索，获得3条与信息探针相似性较高(95％以上)的EST，用DNASTAR中配备的SeqMan软件将3条EST组装为1条重叠群；

因该拼接片段的长度已覆盖1号裂缝，所以这重叠群即为最终的cDNA序列，定名为重叠群1；

将重叠群1与裂缝所在的蜜蜂基因组序列进行相似性比对，获得裂缝序列。其中151个碱基代替了裂缝中的全部N。

实施例2：