[发明专利]一种产1,3－丙二醇基因工程菌及其制备方法和应用

权利要求书

1、一种产1，3-丙二醇基因工程菌，其分类命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-Tet^R。

2、根据权利要求1所述的产1，3-丙二醇基因工程菌，其特征在于该工程菌是通过下列方法制备得到的：利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD，从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因Tet^R，通过多克隆位点将其串联到表达载体pUC18的合适位置，Tet^R基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-Tet^R，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-Tet^R。

3、根据权利要求2所述的产1，3-丙二醇基因工程菌，其特征在于该工程菌通过下列方法制备得到：

(1)基因yqhD的克隆：根据Genebank公布的大肠杆菌E.coli K12中yqhD基因的序列设计合成PCR所需的引物：

P1：5’-GAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’

P2：5’-GGATCCCACTCAGAATGCCTGGCGG-3’

引物两端分别引入EcoR I，BamHI，以大肠杆菌E.coli JM108或E.coli JM109基因组DNA为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，EcoR I，BamHI酶切重组pMD18-T载体，回收其中1.16kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18载体的合适位置，获得重组质粒pUC18-yqhD；

(2)基因Tet^R的克隆：根据质粒载体pHY300PLK中四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物：

P3：5’-GGATCCATGAAATACTGAATTTAAAA-3’

P4：5’-AAGCTTCTTAACGATTTAGAAATCCC-3’

引物两端分别引入BamHI，Hind III，以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应；PCR反应条件：95℃变性5min，经94℃30sec，52℃30sec，72℃1min，30个循环，再经过72℃延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，经BamHI，HindIII酶切回收其中1.56kb片段，根据所述酶切位点连接至pUC18-yqhD载体的合适位置，Tet^R基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-Tet^R；

(3)重组基因工程菌的获得：将重组质粒pUC18-yqhD-Tet^R转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC 25955，涂布含40μg/mL的四环素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为Klebsiella pneumoniae ATCC25955-pUC18-yqhD-Tet^R。

4、如权利要求1所述的产1，3-丙二醇基因工程菌的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：利用PCR技术从大肠杆菌中扩增出1，3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD，从质粒载体pHY300PLK中扩增出四环素抗性基因Tet^R，利用多克隆位点将其串联到表达载体pUC18的合适位置，Tet^R基因置于yqhD的下游，得到重组质粒pUC18-yqhD-Tet^R，重组质粒转化肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae ATCC25955，得到重组肺炎克雷伯氏菌，即产1，3-丙二醇基因工程菌Klebsiella pneumoniaeATCC25955-pUC18-yqhD-Tet^R。