[发明专利]酰乙基苯丙氨酸型镍亲合层析介质在纯化融合蛋白中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种酰乙基苯丙氨酸型镍亲合层析介质在纯化融合蛋白中的应用，属于蛋白纯化技术。

背景技术

酶催化法合成手性药物由于具有耗资少、污染小等一系列优点，市场前景广阔。随着基因工程的发展，大量的酶可以通过克隆表达获得，而融合蛋白的纯化是酶催化法合成手性药物的前提。金属螯合亲合层析作为一种常用的蛋白纯化手段，在融合蛋白的纯化中被广泛应用。该方法利用蛋白质链末端的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能与金属离子发生特殊的相互作用的原理对蛋白质加以分离、纯化。

常规的金属螯合亲合层析介质多以葡聚糖或琼脂糖等软基质作为载体，但这些介质价格昂贵、配基的制备困难、偶联条件激烈，且在制备时常使用溴化氰等剧毒试剂，须采取特殊防护措施。而聚苯乙烯(Polystyrene，PS)作为载体，具有原料来源广泛、价廉且易功能化等优点。已有研究者采用PS作为载体，通过氯甲基功能化制得氯甲基聚苯乙烯(PS-CH₂-Cl)介质，再胺化后引入氨基酸及氯乙酸或氯乙酰氯及亚胺二乙酸(IDA)等配体，最后与金属离子形成三齿的五元螯合环，制备获得金属螯合亲合层析介质。该方法除具有：在合成氯甲基化亲和层析介质中通常要用到有强致癌性的氯甲醚或二氯甲醚等原料，及苯环氯甲基化反应常伴有氯甲基的多取代和二次交联，会影响亲和层析介质的性能外，其合成制备金属螯合环的步骤过于复杂。

发明内容

本发明的目的是采用一种酰乙基苯丙氨酸型镍亲合层析介质(PS-Phe-Ni²⁺)来有效的纯化融合蛋白的方法。

由该PS-Phe-Ni²⁺亲合层析介质纯化融合蛋白的技术方案包括以下步骤：

(1)将融合蛋白溶液加入PS-Phe-Ni²⁺亲合层析介质中进行亲合吸附；

(2)用不同咪唑浓度的缓冲液对上述亲合层析介质进行梯度洗脱，收集每个浓度的洗脱液，测定酶活并取微量经丙酮沉淀过夜，进行SDS-PAGE电泳观察目的蛋白的洗脱位置及杂蛋白的洗脱情况。

本发明的优点：以氯乙酰化聚苯乙烯(PS-Acyl-Cl)为载体，固载苯丙氨酸(Phe)和螯合镍离子(Ni²⁺)，只需两步反应即可制备这种亲合层析介质(PS-Phe-Ni²⁺)，而上述PS-CH₂-Cl亲和层析介质的制备方法至少需要4步。本发明方法所用亲合介质制备方法简单，成本低廉，并克服了氯甲基化亲和层析介质制备过程中使用致癌物氯甲醚的弊端。将其应用于纯化融合蛋白，结果表明该亲和层析介质对蛋白的纯化效果良好，且粗酶液不经过硫酸铵沉淀、透析等预处理，直接可用于亲合纯化，简化了纯化工艺。

具体实施方案

实施例1

称量0.15g PS-Phe-Ni²⁺亲合层析介质，用具塞锥形瓶盛放，加入20％(V/V，下同)的乙醇水溶液10mL溶胀该介质12h。然后用磷酸缓冲液多次置换20％的乙醇溶液，去除介质中的乙醇。

用50mM pH 7.4的磷酸缓冲液将介质全部转移到10mL的离心管中，转移完毕之后将管中的磷酸缓冲液吸净，再加入5mL浓度为11.52mg/mL的醛糖还原酶，用封口膜封口。将离心管固定在摇床上。将摇床置于4℃层析柜中，开启电源，使管内介质在蛋白溶液中适度晃动12h。

吸附结束，测定醛糖还原酶浓度为7.23mg/mL。将介质转移至吸附柱中，分别用10、20、50、100、200、300、400mM咪唑浓度的磷酸缓冲液洗涤介质2-3次，收集每个浓度的洗脱液，测定酶活并取微量洗脱液经丙酮沉淀过夜，进行SDS-PAGE电泳观察目的蛋白的洗脱位置及杂蛋白的洗脱情况。亲和层析介质对醛糖还原酶的吸附量为143.00mg/g，酶活回收率达到80％，纯化后的融合蛋白纯度达到98％，纯化倍数达到30倍。

实施例2

称量0.15g PS-Phe-Ni²⁺亲和层析介质，用具塞锥形瓶盛放，加入20％的乙醇溶液10mL溶胀该介质1h。然后用50mM pH 7.4的磷酸缓冲液多次置换20％的乙醇，去净介质中的乙醇。

用50mM pH 7.4的磷酸缓冲液将介质全部转移到10mL的离心管中，转移完毕之后将管中的磷酸缓冲液吸净，再加入5mL浓度为8.60mg/mL的醛糖还原酶，用封口膜封口。将离心管固定在摇床上。将摇床置于4℃层析柜中，开启电源，使管内介质在蛋白溶液中适度晃动12h。