[发明专利]一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1、一种人分化抑制因子3的表达载体，其特征是将PCR扩增后的hId3基因克隆于融合表达载体pET32a的EcoR I和Sal I位点之间，得到重组表达载体hId3/pET32a，其中hId3基因上游融合了6个组氨酸和硫氧还原蛋白基因片段，利用His标签与Ni离子的亲和作用，融合表达出的蛋白产物用Ni-NAT树脂进一步纯化，hId3与Trx的融合表达增加表达产物的可溶性，携带Trx-His-hId3融合基因的hId3/pET32a处于pET32a的T7启动子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点，便于从融合蛋白中切下Trx。

2、一种人分化抑制因子3融合蛋白，其特征是该融合蛋白是采用权利要求1所述的表达载体转化大肠杆菌BL21进行表达并纯化得到的。

3、根据权利要求2人分化抑制因子3融合蛋白，其特征是该融合蛋白通过下列方法制备得到：用权利要求1所构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，在37℃进行基础培养，当细菌密度OD₆₀₀值为0.4～0.6时，37℃表达3～4小时；收集表达细胞，悬浮于1×Binding Buffer(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，1mmol/L PMSF)，超声破碎细胞，经离心后，取上清液用于Ni-NTA亲和层析柱分离纯化，获得融合蛋白Trx-His-hId3。

4、根据权利要求2或3所述的人分化抑制因子3融合蛋白的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

用权利要求1所述的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃进行基础培养，当细菌密度OD₆₀₀值为0.4～0.6时，37℃表达4小时；收集表达细胞，悬浮于1×Binding Buffer(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，1mmol/LPMSF)，超声破碎细胞，经离心后，取上清液用于Ni-NTA亲和层析柱分离纯化，获得融合蛋白Trx-His-hId3。

5、根据权利要求4所述的人分化抑制因子3融合蛋白的制备方法，其特征在于在纯化过程中，Washing buffer I为：20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，30mmol/L咪唑；Washing Buffer II为：20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mMβ-巯基乙醇，45mmol/L咪唑。

6、一种抗hId3多克隆抗体，其特征在于它是兔源性的多克隆抗体，用凝血酶切割权利要求2或3所述的融合蛋白Trx-His-hId3，用Ni-NTA亲和层析柱再次分离，获得切下Trx-His的hId3蛋白，以此蛋白为抗原作为免疫抗原，免疫具有免疫活性的新西兰白兔而得到。

7.如权利要求6所述的抗hId3多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的免疫过程为用凝血酶切割权利要求2或3所述的融合蛋白Trx-His-hId3，用Ni-NTA亲和层析柱再次分离，获得切下Trx-His的hId3蛋白，以此重组蛋白为免疫抗原，免疫8周龄新西兰雄兔，背部皮下分多点注射；首次免疫时，用纯化的重组蛋白1mg与1ml弗氏完全佐剂充分乳化，于每只兔子背部皮内注射；15天后，加强免疫，剂量同上但用弗氏不完全佐剂，注射于背部皮下；两周后使用加强免疫的方法再次加强免疫；第二次加强免疫10天后，开始取耳缘静脉采血检测抗体效价，用琼脂糖单向扩散试验测得兔源性抗血清的效价，收集抗血清，分装，于-70℃冻存。