[发明专利]含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生 物，利用内皮抑素突变体中含有的非天然氨基酸可以使其与其它分子形成特异性的共价连接。

背景技术

血管生成是一个包括内皮细胞增殖、迁移和分化、细胞外基质降解、微血管形成及芽生 新的毛细血管等多个步骤的过程。它对于胚胎发育，器官形成，组织再生以及创伤修复是不 可缺少的。同时，血管生成又是导致肿瘤生长和转移的必要条件。内皮抑素是能够抑制内皮 细胞增殖的一类血管生成抑制剂，分子量为20KD，能够特异性地抑制内皮细胞的增殖和迁 移。研究发现，内皮抑素主要针对增殖迅速的非正常组织的内皮细胞，例如，肿瘤组织内的 新生血管生成，因此，内皮抑素具有体内抑制肿瘤血管生成以及抗肿瘤作用。而且，由于内 皮抑素是针对不会变异的内皮细胞，且内皮细胞显露于药物的表面，因此，内皮抑素作为抗 肿瘤药物还可以克服耐药性和组织毒性。

目前，内皮抑素主要利用原核系统表达。但由于其内部的非极性氨基酸较多，因此在表 达过程中极易形成包涵体并且难于复性。而使用酵母表达系统大批量生产分泌形式的重组人 内皮抑素生产设备投资巨大，易污染。

除了上述问题外，内皮抑素在临床应用于人体的有效剂量为每天300mg/m²，此剂量对 基因工程药物来说是一个很大挑战。而且内皮抑素稳定性差，血浆半衰期短也有碍于临床应 用。目前，研究者们主要通过聚乙二醇化来解决内皮抑素在临床使用上存在的问题。但是针 对内皮抑素的修饰多为氨基修饰以及N末端修饰，这些修饰方法或者不能定点修饰，使产物 性质不均一，或者修饰条件难于控制，获得修饰产物较少且修饰产物不稳定。

本发明提供的技术方案可以将非天然氨基酸定点引入到内皮抑素中，使之可以在原核表 达系统中获得可溶性表达，同时，利用带有特殊基团的非天然氨基酸可以和其它分子形成共 价结合，达到定点化学修饰的目的。

发明内容

本发明利用可以在内皮抑素非活性位点定点引入非天然氨基酸的原核表达系统在来源于 人的内皮抑素内部定点引入了非天然氨基酸——对叠氮基苯丙氨酸和对乙酰基苯丙氨酸，从 而实现内皮抑素的定点聚乙二醇化。而且，利用这套表达系统，在大肠杆菌中表达了可溶性 的内皮抑素，简化了内皮抑素的复性和纯化步骤。

本发明具体内容为，设计并建立了一套可由大肠杆菌重组表达的，可以在内皮抑素内部 定点引入非天然氨基酸的系统，该系统包括来源于Methanococcus jannaschii属的抑制型 tRNA(tRNA^Tyr)以及氨酰tRNA合成酶(Mj TyrRs)。两者分别由严紧型质粒pAC-tRNA 以及松弛性质粒pBR-TyrRS编码表达。内皮抑素基因经过改造，使非活性位点的氨基酸密码 子定点突变为琥珀密码子TAG，然后构建到载体pAC-tRNA上并与pBR-TyrRS共转染大肠 杆菌感受态细胞，利用Tet和Amp两种抗生素进行双向筛选，筛选后的单菌落接种于带有两 种抗生素的LB培养基扩大培养，添加非天然氨基酸(1mM)和IPTG(1mM)诱导培养后 收集菌体，超声破碎，离心取上清，利用亲和层析纯化后即可获得含有非天然氨基酸的内皮 抑素。

内皮抑素在大肠杆菌表达系统中为包涵体表达，且难于复性。利用上述表达系统可以实 现内皮抑素在原核表达系统中的可溶性表达，获得稳定的皮抑素突变体。本发明充分利用 了系统的定点性，根据内皮抑素的空间结构，选择空间上处于外表的非活性位点，定点引入 非天然氨基酸，在不影响活性的前提下实现了定点聚乙二醇化。

表达的突变内皮抑素经过SDS-PAGE，Western-blotting检测确定所纯化产物为内皮抑 素，纯化产物分别与带有炔基和酰肼基的荧光胺和生物素反应，证实突变内皮抑素带有非天 然氨基酸。经过结构确证之后，利用人脐静脉内皮细胞和牛主动脉内皮细胞在细胞水平上测 活，确定突变内皮抑素具有天然内皮抑素的活性。进一步利用本实验室合成的带有炔基的聚 乙二醇和带有酰肼基的聚乙二醇定点修饰，获得均一的修饰产物。

附图说明

图1、SDS-PAGE分析：用于鉴定突变内皮抑素的表达。

图2、纯化后的突变内皮抑素SDS-PAGE检测。

图3、Western-blotting分析：用于鉴定突变内皮抑素的表达。