[发明专利]结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种结合藻红胆素(PEB)的藻蓝 蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的制备方法。

技术背景

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其 吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红 蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋 白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基 中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半 胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。 藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发 射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的 可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650～660nm的可见光，发射约660～670nm的荧 光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB)；PEC的alpha亚基结 合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB)；PEC的beta亚基结合的辅基色素 为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。

CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J，Cai Y A，Glazer A N.Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(19)：10560～10565)。我 们发现，藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶不仅可以催化PCB与藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白结 合，还能催化藻红胆素PEB与藻蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白结合。通过基因工程技术，藻 蓝蛋白alpha亚基脱辅基蛋白基因克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到藻蓝蛋白 alpha亚基类脱辅基蛋白；把藻蓝蛋白alpha亚基裂合酶基因、PEB生物酶合成基因克隆于表 达载体。利用以上表达载体，通过基因工程菌，可以直接生成结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚 基类荧光蛋白质。

藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。结合PEB的藻 蓝蛋白类荧光蛋白质具有与天然藻蓝蛋白不同的光谱特性可为生物学检测以及医疗检测提供 更多选择。本发明为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于医药和生物工程领域，特别是检 测领域奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的方法。 它是应用藻蓝蛋白alpha亚基裂合催化藻红胆素(PEB)与藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白共 价结合，制备结合PEB的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质。将含有藻蓝蛋白alpha亚基裂 合酶基因、藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因、藻红胆素生物合成酶基因的表达质粒依 次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过这种方法得到的基因工程菌生产结合PEB的藻蓝蛋 白alpha亚基类荧光蛋白质。

本发明的技术方案是这样的：一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白alpha亚基类荧光蛋白质的 制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)用基因工程方法，将alpha亚基裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到 alpha亚基裂合酶表达质粒；

(2)用基因工程方法，将藻蓝蛋白alpha亚基类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第 二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；

(3)用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第 三个表达载体中，得到hol和pebB表达质粒；

(4)用基因工程方法将藻红胆素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四个表达 载体中，得到pebA表达质粒；