[发明专利]检测莱克多巴胺残留的酶联免疫试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种检测动物源性食品中莱克多巴胺残留的酶联免疫试剂盒及其使用方法。

背景技术

莱克多巴胺(Ractopamine)，属于β2-肾上腺素能激动剂(BAA)的一种，与“瘦肉精”同属儿茶酚胺类(肾上腺素和去甲肾上腺素)物质。早在70年代初期，儿茶酚胺类物质及其类似物改善机体营养调配和胴体组成的能力，就由美国氰胺公司研究部所认识。随后便大规模用于畜禽生产以提高瘦肉率，减少脂肪沉积，及增加产奶量等。其中，莱克多巴胺、克伦特罗因其口服效率高在生产中使用最为广泛。

近年来，莱克多巴胺、克伦特罗被大量添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长，但因其添加剂量较大，在动物体内高残留而给消费者带来危害。例如：1989年，西班牙中部发生135人因食用含β2-肾上腺素能激动剂残留的牛肝而集体中毒的事件；1990～1991年，法国里昂地区有8个家庭因食用残留β2-肾上腺素能激动剂的牛肝而集体中毒；1996年，仅意大利就发生62起因食用残留有β2-肾上腺素能激动剂的牛肉和牛肝而集体中毒的事件；中毒症状有肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、肌肉痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等，且有心脏病史的人对食物残留β2-肾上腺素能激动剂更为敏感(尹靖东等，1998)。因此，欧盟采取了严密的措施，通过一系列法规条例严格控制莱克多巴胺、克伦特罗的非法使用。

目前，许多国家已经对莱克多巴胺提出了最高残留限量，如英国在动物可食性组织的最大残留为0.5ng/g，荷兰规定肝组织最大残留量为1ng/g(G.A.Mitchell，et al，1998)。我国农业部1997年3月[农牧发(1997)]3号文严令禁止β2-肾上腺素能激动剂在动物生产中应用，最高残留限量规定为1ng/g(肝组织)或1ng/mL(尿液)。

虽然，国家将β2-肾上腺素能激动剂列为严重危害人民身体健康的违禁药品，禁止生产和使用，但是非法使用现象仍较严重，因食用含有β2-肾上腺素能激动剂的肉类、动物内脏而引发中毒的事件时有发生，例如：2001年，连续发生了广东河源、广东信宜、浙江、上海等地十几起上百人集体中毒的事件。

近年来，国家加大了对克伦特罗非法使用的打击力度，把其作为动物屠宰前后的必检项目，如果检出阳性，整批销毁，且莱克多巴胺价格远低于克仑特罗，使得许多不法分子不用克伦特罗而改用莱克多巴胺，据相关检测部门报告，近年来克伦特罗的使用量有下降的趋势，但莱克多巴胺的使用量却在增加。因此，建立准确、灵敏、快速、简便的检测方法对及时、有效的监测莱克多巴胺的非法使用具有巨大的意义。

通常，检测莱克多巴胺的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱法(GC-MS)，毛细管区带电泳法(CE)和免疫分析技术(IA)等等。HPLC法与GC-MS法是莱克多巴胺残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，而酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法。

目前国内外已有商品化的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒(德国Rbiopharm，英国Randox Laboratories Ltd，北京望尔公司试剂盒等)，但是由于设计原理的问题国内外现有产品普遍存在稳定性差、检测步骤复杂等缺点。例如德国Rbiopharm与英国RandoxLaboratories Ltd产品的设计原理为在微孔条上包被有针对莱克多巴胺抗体的羊抗体，莱克多巴胺抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，再加入莱克多巴胺酶标记物，标准或样品溶液，莱克多巴胺与莱克多巴胺酶标记物竞争莱克多巴胺抗体，没有连接的莱克多巴胺酶标记物在洗涤步骤中被除去，然后显色定量。操作步骤至少需要7步。国内望尔公司产品采用间接竞争ELISA法，在微孔条上预包被上偶联抗原，加入样本与莱克多巴胺抗体，样本中的克仑特罗将和微孔条上预包被偶联抗原竞争克仑特罗抗体，经过孵育及洗涤步骤，然后加入酶标记物，再经过孵育及洗涤步骤后显色定量，操作步骤至少为8步，另外还需专门配制洗涤液，而且反应必须在37℃环境中进行。