[发明专利]乳头瘤病毒检测与分型方法及其液相芯片有效

专利信息
申请号: 200810026275.7 申请日: 2008-02-03
公开(公告)号: CN101250593A 公开(公告)日: 2008-08-27
发明(设计)人: 许嘉森;林一群;杨惠夷 申请(专利权)人: 广州益善生物技术有限公司
主分类号: C12Q1/70 分类号: C12Q1/70;C12Q1/68
代理公司: 广州华进联合专利商标代理有限公司 代理人: 万志香;曾旻辉
地址: 510663广东省广州市广州*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 乳头 病毒 检测 方法 及其 芯片
【说明书】:

技术领域

发明涉及医学体外诊断技术,具体的是涉及一种用于人乳头瘤病毒检测与分型的方法及其液相芯片。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种小分子环状双链DNA病毒,通过性接触、直接或间接接触污染物品等途径在人群中广为传播,特异性地感染人体皮肤和粘膜的鳞状上皮细胞,引起多种良性或恶性病变,严重威胁着人类的健康。根据HPV基因的序列变异可将其分为多种类型。目前确定的HPV型别有100余种,其中约40种可以感染人生殖器官,约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为高危型和低危型,低危型HPV如HPV6、11、40、42、43、44、53和54等型别,常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CINI),高危型HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、61、66、68、73、82及83等型别,与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/III)的发生相关,尤其是HPV16和18型。

大量流行病学和分子生物学研究资料表明HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关,HPV感染是宫颈癌的主要病因。大约80%的低度宫颈癌前病变的病人体内可以分离出HPV,高度宫颈癌前病变的病人中有90%可以分离出HPV,几乎所有患浸润性宫颈癌的妇女体内都能分离出HPV。而宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率高居女性恶性肿瘤的第二位。全世界每年有45万的宫颈癌新发病例,导致死亡的接近25万例。因此,HPV DNA检测及分型对宫颈癌的早期诊断、判断预后以及指导治疗具有重要价值。

由于HPV体外增殖非常困难,到目前为止尚无可靠的血清学分型方法。传统的HPV检测方法主要是通过形态学和免疫组化法对其进行检测,如巴氏涂片法,薄层液基细胞学检查,阴道镜检查,组织病理学检查,电镜直接观察HPV病毒颗粒,放射免疫沉淀法检测患者血清HPV16抗体水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中HPV-E6,E7特异性抗体等。然而这些方法的检测灵敏度和特异性均不够理想,存在较高的假阳性率和假阴性率,同时无法做到早期诊断,更不能对HPV进行分型。HPV常用的分型方法有核酸杂交(包括斑点杂交法、荧光原位杂交法、southern杂交法以及杂交捕获法),聚合酶链反应(PCR)技术(直接测序法、限制性片段长度多态性分析、杂交法以及目前很具影响力的基因芯片法)等。Southern杂交法是HPV基因分型的金标准,但此方法敏感性低、耗时、需要大量高度纯化的DNA,而且需要新鲜样本,不能用于DNA已降解的组织,故不适合于临床HPV分型的检测应用。荧光原位杂交法(ISH)能够在组织病理中估计目的核酸或基因的表达,但ISH测定HPV序列的敏感性很低。杂交捕获法(Digene公司HC II)是目前唯一通过FDA批准的可在临床使用的HPV DNA检测技术。该技术敏感性较好,重复性高,但不能确定具体的HPV亚型,且存在交叉反应,影响其检测的准确性。PCR技术检测灵敏度高,操作简单,但具有样品易污染、假阳性率高等缺点,同时,普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。随着越来越多高危型HPV种类的确定,必须建立一种能同时检测至少15种高危型HPV的方法。基因芯片技术用于HPV分型检测,能一次检测多种常见类型的HPV,但传统的固相芯片价格昂贵,而且敏感性不高,检测结果的可重复性差。基于芯片的原理,美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体,以荧光检测仪作为检测平台,对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中,掺入不同比例的红光及红外光染色剂,从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子,报告分子以生物素标记,并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测,其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度,并根据微球中不同色彩而编号分类,从而确定反应的类型;绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度,再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量,从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此,液相芯片技术既满足了高通量检测的要求,同时具备了快速准确,灵敏度高,特异性好,结果重复性好等优点。将液相芯片技术应用于人乳头瘤病毒HPV检测与分型将具有极大的优势。

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