[发明专利]一种玻璃化冻存液

说明书

技术领域

本发明涉及一种组织和器官保存用的玻璃化冻存液。

背景技术

低温保存生物材料，特别是组织和器官，是低温生物学领域研究的重要目标之一。目前，细胞和胚胎等简单组织的低温保存已经取得了明显的效果，但是复杂组织和器官的保存还存在一定程度的局限。原因是当低温作用于生物体时，其内部不可避免地发生水的结冰，不论是细胞内结冰还是细胞外结冰，都会导致细胞活性和功能的丧失，并且在-15--50℃这个温度区间内，细胞内外极易形成大量冰晶从而导致细胞失活。在冷冻和复温过程中，细胞必须两次通过这一危险温度区间。因此，有效保护细胞安全通过这一温区，避免冰晶形成造成的损伤，是生物材料成功保存的关键。

玻璃化是指液态转变为非晶态的固化过程。玻璃化方法就是在完全玻璃化状态下保存生物材料的一种方法。玻璃态固体能保持液态时正常的分子和离子分布，可以避免因结冰对生物材料造成的物理性损伤。在可实现的降温速率下，玻璃化法需使用多种防冻剂配成高浓度的玻璃化溶液，当温度降低后，整个溶液变得非常粘稠，最终进入一种玻璃化状态。玻璃化方法操作简单快速，是一种非常有前景的低温保存方法。玻璃化方法已经成功用于胚胎等简单组织的保存，但目前还不能确定能否最终解决组织和器官的保存。

低温保护剂分为渗透性和非渗透性两大类。渗透性防冻剂多是一些低分子量的中性物质，它们能渗入细胞内部，降低冰点、减少冰晶形成、稀释溶液中电解质的浓度、减少溶质损伤、平衡细胞内外渗透压和减轻细胞缩水程度。常用的渗透性防冻剂主要有甘油、二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇等小分子多羟基醇。非渗透性防冻剂的分子量较大，不能进入细胞内部，它们通过稀释细胞外电解质的浓度减少溶质损伤，通过减少细胞外自由水含量以达到减少胞外冰晶的损伤。常用的非渗透性防冻剂有蔗糖、葡萄糖、海藻糖、牛血清蛋白、白蛋白、透明质酸钠以及羟乙基淀粉等。单一的防冻剂各有优缺点，不能满足生物材料低温保存的多方面要求，通常情况下采用两种或两种以上混合使用。渗透性防冻剂一般具有毒性作用，非渗透性防冻剂会引起细胞过度缩水，二者混合使用可以弥补上述缺点，提高保存效果，还能促使溶液某些热力学参数的改变，比如玻璃化温度升高，玻璃化所需浓度降低等。这些改变对于玻璃化保存生物材料是非常有益的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺点，提供一种同时含渗透性和非渗透性低温保护剂，能有效形成低温玻璃化冻存的玻璃化冻存液。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种玻璃化冻存液，每100毫升溶液中含有：

聚乙烯醇       0.1～5克

二甲基亚砜     1～30克

1，2-丙二醇    1～30克

余量为水。

其优选的比例是每100毫升溶液中含有：

聚乙烯醇         1～5克

二甲基亚砜       10～20克

1，2-丙二醇      10～20克

余量为水。

本发明选择二甲基亚砜(DMSO)和1，2-丙二醇(PE)为渗透性防冻剂，选择与防冻蛋白有相似的、能够阻止冰晶生长并抑止重结晶特点的聚乙烯醇(PVA)为非渗透性防冻剂，形成一种多组分的玻璃化冻存液。此多组分的玻璃化冻存液体系具有较强的玻璃化能力，表现在降温过程中易于进入玻璃化状态，并只有很少部分的水形成晶体。同时还需要保证玻璃化溶液在升温过程中的稳定性，表现在升温过程中去玻璃化或重结晶延迟，有明显的重结晶抑制特性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.与已公开的多组分冻存液相比，本发明的冻存液同时含渗透性和非渗透性低温保护剂，尤其采用聚乙烯醇为非渗透性防冻剂组分，具有明显的阻止冰晶生长及抑止重结晶作用，可以有效形成低温玻璃化冻存效果。

2.本发明的多组分玻璃化冻存液体系同时考虑了保护剂的毒性、渗透性、玻璃化能力、玻璃化稳定性以及升温降温速率等因素。所以不只在降温过程中易于进入玻璃化状态，而且还能保证玻璃化溶液在升温过程中的稳定性。而现有冻存技术中玻璃化溶液从低温保存状态平稳复温到常温状态是较难实现的。

3.本发明的多组分冻存液具有简单而且通用的效果，适于各种细胞、组织及器官的玻璃化冻存。

具体实施方式

实施例1