[发明专利]从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1－抗胰蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种α1-抗胰蛋白酶的制备方法，尤其是从人血浆组分沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。

背景技术

α1-AT主要是由肝细胞合成的一种糖蛋白，分子量54KD，体内半衰期6d。α1-AT是人血浆中最丰富的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如抑制弹性蛋白酶、胰蛋白酶、纤溶酶、胶原酶、凝血酶和Hageman因子等的活性。α1-AT是血液中最主要的抗胰蛋白酶，占血清胰蛋白酶抑制活性的90％以上。α1-AT具有较强的血管通透性，在肺组织中浓度高，而且对弹性蛋白酶活性更专一，它的主要生理功能是抑制肺部弹性蛋白酶的活性，保护肺部不受弹性蛋白酶的酶解损伤。

人体血浆中α1-AT缺乏直接相关的疾病主要是肺和肝脏疾病。如阻塞性肺气肿、新生儿或成人呼吸窘迫综合征、肺部囊性纤维化、儿童肝硬化和新生儿肝炎等，病情严重导致患儿夭折。

对于α1-AT缺乏症的治疗主要是进行替代治疗和基因治疗。但由于基因疗法目前尚处于实验阶段，具有一定的局限性，因此α1-AT替代或补充治疗此类疾病是主要方法。我国目前尚无该产品的生产，市场需求主要依靠进口产品来满足。

国内外都开展了α1-AT的生产研究。Gadek等应用两步沉淀过程制备临床应用的α1-AT浓缩制剂，α1-AT仅占浓缩制剂蛋白总量的5％。Glaser等建立了独特的α1-AT制备工艺，采用二硫苏糖醇处理结合硫酸铵沉淀，DEAE-纤维素层析，从Cohn’s低温乙醇工艺的废弃组分FIV-1中提纯出纯度70％的α1-AT浓缩制剂。朱威等^[9]从Cohn组分FIV中提纯α1-AT。将Cohn组分FIV抽提液经沉淀，超滤，离子交换及凝胶过滤后，提纯α1-AT，用巴氏法灭活病毒，并考察其效果。用免疫单扩散、双向交叉免疫电泳、SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT蛋白活性，用区带扫描法测其纯度达90％以上。

上述工艺主要采用沉淀法或沉淀结合层析法纯化α1-AT，产品纯度在70％-90％左右，纯度较低；本发明采用两步层析法纯化，设备仪器少，操作简单易行，产品纯度高，α1-AT电泳纯度达到98％。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种新的从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，以降低生产成本及提高纯度。

为了达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

(A)血浆沉淀预处理：取FIV沉淀加溶解液稀释到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，离子强度0.09-0.12，温度控制在2～8℃搅拌过夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌1h，固液分离，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)再次加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌3h，固液分离，取上清液进样层析柱；

(B)阴离子凝胶层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液洗脱平衡，pH6.0～6.5，平衡量为柱体积的8～12倍，将上清液上样于平衡好的层析柱，用缓冲液洗脱，pH6.0～6.5，温度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有a 1-AT为主要成分的组分；

(C)凝胶过滤层析：取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液平衡，将层析后收集的a1-AT的组分调至pH 7.0-7.5，上样于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的缓冲液洗脱，同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a 1-AT的组分；

(D)超滤脱盐浓缩；

(E)巴氏病毒灭活：将浓缩蛋白液加无热原注射用水稀释，加入保护剂，于60±0.5℃保温8～12小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒；

(F)冻干分装：巴氏灭活的a 1-AT蛋白液经除菌过滤，转入冻干机真空冻干；

(G)干热消毒：分装的冻干粉针放置于保温库中保温，灭活病毒，转入成品库全检包装。

本发明是以人血白蛋白生产过程中产生的弃料FIV组分沉淀为原料，采用层析技术分离纯化一种蛋白酶抑制剂即α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)，建立α1-AT浓缩制剂的生产工艺。本方法制备的产品纯度好、收率高，操作简单易行，同时占用设备少、劳动强度小、能耗低，以白蛋白生产的废弃物料作原料，生产成本低。

附图说明

图1为工艺流程图。