[发明专利]一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法

说明书

技术领域

本发明属于中药活性成分筛选及作用机制研究领域，特别涉及一种筛选中药镇痛活性成分和确定其结合的阿片受体亚型的细胞膜色谱模型的建立方法。

背景技术

传统的中药活性成分筛选模式，如整体动物、系统、器官模型，存在着研究周期长、花费高、效率低的缺点；酶、受体模型无法反映中药多组分、多靶点的特点。在众多模型中，细胞膜色谱法脱颖而出，成为高效筛选中药活性成分的新方法。

细胞膜色谱法(Cell Membrane Chromatography，CMC)是将人或动物的活性组织细胞膜固定在特定载体表面，制备成细胞膜固定相，通过紫外在线检测被分析成分在细胞膜固定相上的保留特性，所得色谱参数与药物和细胞膜及膜受体特异性结合密切相关，已成功用于多种中药的活性成分筛选，克服了以往先从中药中分离有效部位或单体，再分析其药效，从而使成分分离与效应筛选脱节的弊端，是一种化学成分——效应——作用机制联动的药物研究方法。但此法同时也存在着不能满足细胞膜所需要的温度、压力、离子强度及溶液pH等要求，且不能完全排除非特异性结合的问题。

现代研究表明阿片类药物是通过作用于阿片受体而产生镇痛作用的，体内阿片受体至少存在8种亚型，除中枢分布的阿片受体外，输精管上也含有丰富的阿片受体，如小鼠输精管主要含δ受体，也有部分μ和κ受体，家兔输精管含单一的κ阿片受体，金仓鼠含有δ阿片受体，大鼠输精管被认为含有ε受体。通过使药物作用于不同种属输精管平滑肌细胞，考查其解离液在高效液相色谱柱上的行为，并用阿片受体激动剂和拮抗剂作参比，即可考查该药物与某种阿片受体亚型的亲和力。目前，已有人成功培养大鼠输精管平滑肌细胞(Deferential Smooth Muscle Cell，DSMC)，但小鼠DSMC和兔DSMC的体外培养未见报道。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种可同时筛选镇痛中药活性成分和确定其结合的阿片受体亚型的细胞膜色谱法。本发明将生物学部分与化学部分分开进行，有利于保持靶点的活性，能发挥特异性结合和色谱分析各自的长处。本发明所建立的输精管细胞膜色谱法联合应用了细胞萃取、高效液相色谱，对于多组分、多靶点的中药活性物质的筛选有很高的适用性。

同时，本发明以富含不同阿片受体δ及κ亚型的小鼠、兔输精管细胞膜为研究对象，用输精管细胞膜色谱法特异性的研究中药白芷和阿片受体的亲和力，利用药物效应的发挥是通过药物与细胞靶点(受体)特异性结合的原理，证实了输精管细胞膜色谱法确实可以反映白芷和阿片受体结合的特异性和选择性。阐明了筛选出的白芷镇痛活性成分对阿片受体有选择性，且只特异性的结合阿片受体κ亚型，而与δ亚型无关。利用该模型研究制草乌获得了相同的结果，因此该模型为其他镇痛中药的高选择性快速筛选提供了新的方法，在中药物质基础和作用机制研究领域有广阔的发展前景。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种可同时筛选镇痛中药活性成分和确定其结合的阿片受体亚型的细胞膜色谱法，包括如下步骤：

(1)白芷醇提液指纹图谱的建立：称取20g白芷药材，加入160ml 95％乙醇，回流提取1～2h，挥干乙醇，残渣用甲醇溶解定容至20ml，从中取250μl用甲醇稀释至7.5ml，过0.45μm微孔滤膜，得到滤液即为白芷醇提液；吸取滤液20μl，采用高效液相色谱(HPLC)方法进行测定，得到白芷醇提液有效成分群指纹图谱，确定其特征峰(具体见本申请人的在先专利申请，申请号为200610036947.3)，共13个共有指纹峰。

所述高效液相色谱分析条件：以甲醇-水为流动相系统，柱温30℃，进样量20μl，波长254nm，长度为250mm、直径为4.6mm的Lichrospher5-C18色谱柱，流动相梯度：0～5min，5％～20％甲醇；5～15min，20％甲醇；15～20min，20％～70％甲醇；20～30min，70％甲醇；30～40min，70％～90％甲醇；上述均为体积百分比；

所述白芷醇提液指纹图谱的13个共有指纹峰(特征峰)各相对保留时间分别为(以11号峰为参照)：

1号峰：0.031～0.034；2号峰：0.086～0.088；3号峰：0.607～0.649；

4号峰：0.658～0.665；5号峰：0.704～0.708；6号峰：0.730～0.739；

7号峰：0.749～0.755；8号峰：0.810～0.816；9号峰：0.842～0.847；

10号峰：0.856～0.861；11号峰：1；         12号峰：1.085～1.087；