[发明专利]一种缓释生物活性多肽的方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种以血浆蛋白酶或者血液的微碱性 pH为基础缓释生物活性多肽的方法与应用。

背景技术

多肽在水溶液中没有特定的三维空间结构。分子量小于6千道尔顿的多 肽可通过特异性地结合细胞信号途径中的蛋白质受体或者适配体来发挥独特 的生物作用。因此，在获得有效的小分子药物之前，对于那些迫切需要治疗的 疾病，例如糖尿病、癌症、艾滋病等，肽或者多肽类似物作为能够靶向性作用 于那些偏轨的蛋白质-蛋白质信号作用，将是治疗这类疾病的有效手段。然而， 肽类药物易被血浆蛋白酶水解，并被清除出体循环系统，使得它们的半衰期缩 短而在临床使用中受到限制。因此，需要通过改善这些肽类的药物代谢动力学 特性，以增强这些肽类药物在体内的功效。

目前的许多方法中，把一个生物活性蛋白(这个蛋白在给药以后易被清除) 和一个血浆蛋白(这个蛋白是自然存在的，具有低的清除率)偶联在一起，是 一种有前景提高生物活性肽半衰期的策略(Sheffield WP，Cardiovacs Haematol Disord 1，1-5，2001)这种融合蛋白临床应用的优势是能够减少药物注射的频率 和提高药物在体内的浓度。一些病原体为免遭排斥而进化获得了特异性地结合 到免疫球蛋白、白蛋白、纤维结合蛋白或者纤维蛋白素原等循环的蛋白质衍生 物分子，以上策略与这种病原体的策略相似。

实际应用中，具有治疗作用的蛋白质或者肽往往是通过与血清白蛋白结合 来改善其自身的半衰期短的药物代谢动力学性质。血清白蛋白是哺乳动物血液 循环系统中最丰富的蛋白(人的血液中含量为40g/L)。人血清白蛋白广泛地 分布于身体地各个部分，特别是在肠和血液这两个部分，在血液中，它主要与 维持渗透压有关。人血清白蛋白是一种天然的载体，它参与内源性的运输，它 能够传送数目众多的天然存在的分子，同样它也能够传送治疗的分子(Sellers 等，Albumin Structure，Function and Uses，eds by Rosenoer VM et al，Pergamon， Oxford，p159，1977)。结合脂类、胆红素等分子就是它的功能之一。人血清白 蛋白的半衰期是19天(McCurdy TR et al，J Lab Clin Med 143，115-120，2004)。 这为延长治疗用的蛋白质或者多肽在体循环半衰期提供了一种有希望的方法。 把蛋白直接共价的偶联到血清白蛋白上，或者连接到能够与血清白蛋白相互作 用的肽或者蛋白上，这两种策略都已经被报道，且都能够导致蛋白在体内的半 衰期的延长。利用白蛋白结合肽或者链球菌G蛋白的衍生物来延长在血液中 的清除率很高的蛋白的半衰期(EP486525；US 6267964)。Roland Stork等 报道了将抗体与链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域(ABD)融合而改善抗体 的药代动力学特性的策略(Roland Stork，Dafne Müller和Roland E.Kontermann’ Protein Engineering Design and Selection，doi：10.1093/protein/gzm061)。这个策 略也用于单链双特异性抗体(scDb CEACD3)，融合抗体能够把细胞毒性T淋巴 细胞导向到表达CEA的肿瘤细胞。这种新颖的具有三种功能的融合蛋白 (scDb-ABD)可在哺乳动物细胞中被表达，且它能够同时识别人和鼠血清白蛋 白这两种抗原。这个策略只增加了一个小的蛋白结构域(即46个氨基酸)，利 用了与血清白蛋白的高亲和力的非共价的相互作用，有希望将被广泛地用于改 善小的重组抗体分子的血清半衰期。Dafne Müller等构建了一些重组的双特异 性的抗体和血清白蛋白的融合蛋白，并分析了这些分子的生物活性和药代动力 学性质(Dafne Müller，Anette Karle，Bettina Meiβburger，Ines ，Roland Stork， 和Roland E.KontermannJ.Biol.Chem.，282，12650-12660，2007)。重组抗体的三 个部分是由两个不同的scFv分子，双特异性的scDb或者taFv分子分别与人 血清白蛋白融合而成。这些重组体抗体(scFv₂-HSA，scDb-HSA，taFv-HAS)能 够直接与肿瘤抗原、癌胚抗原以及T细胞受体复合物CD3相互作用，而且它 们保留了未融合的所有结合能力。Dennis等利用噬菌体展示肽文库筛选出相 对较短的多肽来结合到血清白蛋白上，这些肽能够与血清白蛋白结合，同时它 们与具有肿瘤靶向性的生物活性化合物相连(Mark S.Dennis，Min Zhang，Y. Gloria Meng，Miryam Kadkhodayan，Daniel Kirchhofer，Dan Combs，和Lisa A. Damico，J Biol Chem 277，35035-35043，2002)。这些融合物的半衰期比单独 生物活性肽长，并与那些由PEG共价修饰的生物活性肽分子的半衰期相当。 另一方面，血清白蛋白融合物提供了一种新的普遍适用的方法，这个方法能够 改善那些被快速清除的蛋白的药代动力学特性。Dennis等还利用抗体Fab4D5， 即一个从单抗trastuzumab(HERCEPTIN)中获得的双功能分子，它能够同时结 合血清白蛋白和肿瘤抗原HER2(erbB2)(Mark S.Dennis，Hongkui Jin，Debra Dugger，Renhui Yang，Leanne McFarland，Annie Ogasawara，Simon Williams， Mary J.Cole，Sarajane Ross and Ralph Schwall，Cancer Res，67，254-61，2007)。 更重要的是，AB.Fab4D5不会像Fab4D5那样在肾脏中蓄积，这说明这个双功 能分子与血清白蛋白的相互作用改变了它的清除路径和新陈代谢途径。快速的 靶向作用，优良的肿瘤沉淀和滞留可能使AB.Fab成为一个用于成像和肿瘤治 疗的特殊分子。Vladimir Tolmachev等报道说，通过与血清白蛋白的可逆结合 能够有效地降低肾脏的排泄和吸收(Vladimir Tolmachev，Anna Orlova等， Cancer Res，67，2773-82，2007)。