[发明专利]一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及己酸乙酯的制备方法，特别是涉及一种用全细胞酶制剂高效地催化合成己酸乙酯的新生产工艺。

背景技术

己酸乙酯是酿酒行业常用的调香物质，是浓香型白酒(如五粮液)的主体风味物质，其含量高低直接影响曲酒的品质也是白酒质量的重要指标之一。每年我国用于浓香型曲酒调香的己酸乙酯达3000多吨，价值上亿元。目前这些标着食品级的己酸乙酯的生产采用基本上采用化学合成法，用硫酸或对甲苯磺酸作催化剂，由己酸和乙醇直接酯化反应。化学法合成的己酸乙酯调配白酒时会产生外加香精的“浮香”，残留的催化剂会与加浆用水中的金属离子产生白色混浊或沉淀，直接影响白酒质量，同时副反应容易生成有毒物质。同时由于副反应造成后处理困难，产品质量不高，酸催化后还造成大量废液。现虽有使用其他催化剂的报道，如钛酸四异丙酯、硫酸锆、水合硫酸铁等，但由于催化剂成本、活性、以及产品质量等问题还难以取代酸催化方法。

随着人们对生产环境的关注，对高品质、尤其是对天然品的需求日益增加，用生物技术生产己酸乙酯酯引起了人们的广泛兴趣。本专利提出的微生物酶法合成己酸乙酯是有望取代化学合成法的工艺。微生物酶法不但反应条件温和、能耗低，三废少，反应速率和转化率高，而且产品纯度高，使用微生物酶法合成的己酸乙酯调配白酒时，产品风味柔和、香醇自然。美国联邦法规已确认酶在有机相中催化合成的己酸乙酯是高质量的天然品。和化学合成法相比，微生物酶法具有反应条件温和、转化率高、专一性好、易提取、易控制等优点，被看成是很有希望工业化的新途径。

专利号为03116567.2的中国发明专利公开了一种高转化率的生物催化合成己酸乙酯的工艺方法，该方法采用己酸和乙醇为原料，在生物催化剂脂肪酶的作用下发生酯化反应，得到己酸乙酯产品；在反应过程中，反应产生的水分不断地通过选择性水透过膜被吸水性盐或水合盐吸收，使反应持续地朝酯化合成方向进行，直至反应物接近完全转化。该方法既可以吸收反应的生成水，又可以使反应体系保持微水环境，技术上保证了高效合成己酸乙酯。但该方法是用聚苯乙烯大孔吸附树脂固定脂肪酶，不适用于柱反应系统，酶在固定化过程种难免出现酶活损失，酶固定化也需要一定的条件，传质过程常有扩散限制，重复使用中酶活力逐渐降低，导致产物转化率低。还有采用游离的脂肪酶通过生物催化合成己酸乙酯。由于酶的分离、再生、循环使用很困难，存在反应时间长、特别是生产过程中酶易失活，如选用高活力的脂肪酶如Novo435，价格昂贵，应用于工业化大生产成本过高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供反应时间短、产率高、操作稳定性好、成本低的全细胞酶制剂催化合成己酸乙酯的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，在于包括如下步骤：

(1)全细胞酶制剂的生产：将脂肪酶基因克隆到携带酿酒酵母絮凝素基因(pKFS)的毕赤酵母表面展示载体中，构建毕赤酵母表面展示表达载体pKFS-lipase(真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表达载体)，pKFS-lipase经线性化后转化毕赤酵母宿主菌，筛选获得在毕赤酵母表面展示活性酶蛋白的重组酵母基因工程菌，工程菌经摇瓶发酵，收获菌体真空冷冻干燥24h以上制成全细胞酶制剂；

(2)己酸乙酯的合成：采用己酸和乙醇为原料，以全细胞酶制剂为催化剂，以能够溶解己酸和乙醇的液态物质为溶剂发生酯化反应，得到己酸乙酯产品，底物中己酸含量为0.2mol/L～1.8mol/L，己酸和乙醇的摩尔比为1∶0.75～1∶5，酯化反应温度为20-90℃；反应物中全细胞酶制剂用量为10-90g/L(反应体系中的浓度)，反应时间12h以上。

相对于现有技术本发明具有如下优点和有益效果：

本发明采用以展示有高活力脂肪酶的毕赤酵母全细胞酶制剂作为催化剂，具有固定化酶的优点，反应时间短、产率高、操作稳定性好。反应后离心收集菌体即可重复利用，大大降低生产成本。酵母具有良好的生物安全性，其取代化学载体固定脂肪酶生产己酸乙酯，完全符合绿色食品的要求。本发明涉及这种毕赤酵母全细胞酶制剂冻干粉在非水相的反应体系中，以有机溶剂为溶剂，能有效的催化己酸和乙醇酯化生成己酸乙酯，反应12h后，己酸的摩尔转化率可超过98％，经过10批次的连续使用，全细胞酶制剂仍然在每批次中使己酸的转化率保持在95％以上，具有良好的操作稳定性。

附图说明

图1是pKFS载体结构示意图。

具体实施方式