[发明专利]一个小分子非编码RNA基因hsa－miR－101及其抗肿瘤用途

说明书

技术领域

本发明涉及一个与原发性肝癌相关的小分子非编码RNA基因hsa-miR-101，以及该基因在辅助诊断与治疗原发性肝细胞癌方面的用途。该发明属于生物技术领域。

技术背景

原发性肝细胞癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的主要发生地，肝癌的发生率高达十万分子三十五。近年来肝癌发病率有明显上升的趋势，严重危害人类的健康与生命安全。

微小RNA(microRNA)是广泛存在于各种生物物种内的一类小分子非编码的核糖核酸，其长度约为20-22个碱基。它不编码蛋白质或多肽，而是通过与靶基因的mRNA(信使RNA)的3’UTR(3’端非翻译区)的特异性结合，促进其降解或抑制其翻译过程来实现对基因表达的调控。许多证据表明，microRNA参与了细胞的多种生物学过程，其自身调控的异常直接影响着恶性肿瘤的发病及恶化。由于microRNA与肿瘤发生的密切关系，它们在肿瘤诊断和治疗中可能具有极为广阔的应用前景。

我们首先利用cDNA芯片技术高通量检测了HCC与对照标本中存在的miRNA表达改变。通过比较癌与非癌肝组织中miRNA表达谱的差异，我们鉴定了41个在肝癌中表达发生显著改变的miRNA，并选取了其中的hsa-miR-101进行较深入的功能探讨。结果发现hsa-miR-101在70％以上的HCC病例中以及所有肝癌细胞株中均低表达，提示hsa-miR-101可能具有抑癌基因活性。进一步的实验结果表明，过表达hsa-miR-101可提高肿瘤细胞对血清饥饿和多种化疗药物包括curcumin、etoposide和doxorubicin的敏感性。我们还发现，hsa-miR-101可有效抑制肿瘤细胞体外的集落形成能力以及体内的成瘤能力。这些结果表明hsa-miR-101不仅可作为临床上肝癌诊断的辅助指标，而且在肝癌治疗中有着非常广阔的应用前景。

经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有关hsa-miR-101与原发性肝癌的研究报道。

发明内容

本发明公开了一种能有效抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的小分子RNA基因hsa-miR-101，及其在原发性肝癌诊断和治疗方面的用途。该基因成熟体序列有以下核苷酸组成：

5’-AUGUCAUUUAAUUACUUAAGC-3’

首先，本发明的小分子RNA基因hsa-miR-101在大多数肝癌组织中下调明显，因此在肝癌的临床诊断及预后判断方面，有重要的参考意义；

其次，本发明的小分子RNA基因可以有效降低肝癌细胞的增殖及成瘤能力，可有效促进肝癌细胞对血清饥饿及各种化疗药物的敏感性，因此是一种全新作用机制的抗肿瘤药物，在肝癌治疗中有极为重要的应用前景。

附图说明

图1：Northern blot检测hsa-miR-101的表达水平。A，hsa-miR-101在不同细胞株，人非肝癌组织(N699)以及成年小鼠正常肝(mLiv)中的表达水平；B，hsa-miR-101在成对的肝癌(T)与癌旁(P)组织中表达水平的比较。

图2：hsa-miR-101能提高细胞对凋亡刺激的敏感性。A，在血清饥饿环境下，过表达hsa-miR-101促进HepG2细胞的凋亡；B，过表达hsa-miR-101后HepG2在血清饥饿时的细胞活力明显下降；C，在血清饥饿环境下，过表达hsa-miR-101导致HepG2细胞caspase-3/7活性提高，此作用可被hsa-miR-101的抑制剂回复，D，hsa-miR-101导致不同肝癌细胞株对血清饥饿诱导的凋亡敏感；E，hsa-miR-101促进HepG2细胞在不同化疗药物刺激下的凋亡，其中用etoposide，curcumin及doxorubicin的处理浓度和时间分别为1.5μg/ml，48hrs；12.5μM，48hrs；0.2μg/ml，36hrs。关于实验组组间差异的比较，除图中用明确标识的比较组别外，其余均是对hsa-miR-101与平行的细胞组或NC进行的比较。数据来自三次独立实验。*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。

图3：过表达hsa-miR-101显著抑制了HepG2细胞在裸鼠的皮下成瘤能力，图示4周后肿瘤的形成情况代表图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，来进一步说明本发明。需要注意的是，以下实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的hsa-miR-101可以采用常规的化学合成方式合成。

实施例1：hsa-miR-101在肝癌组织标本中表达水平的检测