[发明专利]一种酵母蔗糖酶的化学修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学、生物化学和酶工程等学科的交叉技术领域， 更具体地说涉及一种蔗糖酶的化学修饰方法。

背景技术

利用大分子或小分子修饰剂对酶分子的侧链进行改造，以获得具 有临床和工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的酶化学修饰技 术。

当前修饰技术中被广泛应用的小分子化合物有氨基葡萄糖、乙酸 酐、硬脂酸、邻苯二酸酐等，如环糊精转糖基酶经丁二酸酐修饰后， 其环化、偶合和水解的活性降低，而歧化活性却提高了30％。D-葡糖 胺与未糖基化的RNase A进行化学偶联，得到单糖基化酶和双糖基化 酶，其中53位的天冬氨酸和49位的谷氨酸被认为可能是糖基化位点， 经过修饰的单糖基化RNase A活力比天然酶低，但是热稳定性大大提 高。

大分子化合物对酶分子的化学修饰是目前国际上酶工程的研究 热点之一。大分子化合物如聚乙二醇、羧甲基纤维素、右旋糖酐等对 酶蛋白表面进行修饰，可以降低酶的免疫原性和增加酶的热稳定性。 一般而言，化学修饰可以快速改变酶分子的酶学、理化特性及其医学 性质，因而有着重要的应用研究价值。

然而在实际应用中，由于大分子化学修饰的随机性，修饰后往往 会降低酶的催化活性和稳定性。也就是说现有技术对酶进行化学修饰 后修饰酶存在缺陷：要么稳定性有所提高但催化活性急剧下降；要么 催化活性有所提高但稳定性直线下降。因此寻找科学的方法同时提高 修饰酶的活性和稳定性是大分子化合物修饰酶分子技术的重点和难 点。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，针对酶蛋白经大分子化合 物修饰后往往酶活性降低的缺陷，提供了一种利用大分子化合物对酵 母蔗糖酶进行化学修饰的方法，合理的设计了修饰的步骤和条件，修 饰产物的催化活性大幅度提高且稳定性有所增加，可以在常温常压下 发挥其高效催化性能。

本发明的技术方案是提供一种酵母蔗糖酶的化学修饰方法，包括 以下步骤：

(1)酵母蔗糖酶的活化；

(2)采用多糖类大分子作为修饰剂对活化酵母蔗糖酶进行修 饰。

步骤(1)所述酵母蔗糖酶的活化包括以下步骤：

(a)酵母蔗糖酶溶于缓冲液中并定容，使酵母蔗糖酶浓度为5 mg/mL，加入与定容后体积相等的高碘酸钠水溶液；

(b)在上述(1)体系中以酵母蔗糖酶∶底物＝1∶20～100的比 例加入保护底物；

(c)将上述(2)体系置于0～70℃培养箱内反应0.5～4小时 后，加入乙二醇，迅速混匀后静置2小时，对0.1mol/L缓冲液透析 过夜，得到活化的蔗糖酶。

上述步骤(a)所述高碘酸钠水溶液的浓度为10～80mg/mL。

步骤(2)所述活化酵母蔗糖酶的修饰包括以下步骤：

(d)活化后的蔗糖酶中加入与活化步骤中等质量的底物进行保 护；加入溶于pH 8.0缓冲液中的修饰剂溶液，置于0～70℃下搅拌 反应0.5～48小时；

(e)在不断搅拌的条件下往(1)中加入NaBH₄水溶液，持续搅 拌4小时后，对0.1mol/L缓冲液透析过夜，得到修饰的蔗糖酶。

上述步骤(e)所述NaBH₄的用量为与酵母蔗糖酶的比例为5∶8～ 16，浓度为40～80mg/mL蒸馏水。

本发明所述缓冲液为醋酸缓冲液，浓度为0.1mol/L，pH范围为 2.0～10.0。

所述底物为蔗糖。

步骤(d)所述修饰剂与酵母蔗糖酶的比例为5∶2～16，浓度为 5～40mg修饰剂/mL缓冲液。

所述修饰剂为分子量为3000～18000的壳聚糖。

本发明的有益效果是：

(1)本发明针对天然酵母蔗糖酶催化活性低、稳定性差等问题， 用一种大分子化合物对天然酶进行化学修饰后得到催化活性大大提 高而稳定性也有所提高的修饰产物，修饰产物的催化活性大幅度提高 且稳定性有所增加，可以在常温常压下发挥其高效催化性能等优点。

(2)本发明所采用的大分子化学修饰剂具有原料丰富，修饰条 件温和，降低酵母蔗糖酶在工业应用上的生产成本，拓宽其应用，具 有重要的应用价值。

(3)本发明方法简单易行，技术成熟，容易推广。

附图说明