[发明专利]一种流感病毒疫苗种子株的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种流感病毒疫苗种子株的制备方法，特别涉及一种利用腺病毒载体在Vero细胞中进行流感病毒疫苗种子株的制备方法。

背景技术

流感病毒隶属于正粘病毒科，病毒基因组含有多个负链RNA(7-8节段)组成，在甲、乙、丙三型中，甲型流感病毒可以通过抗原漂变和抗原重组两种方式进行变异以逃避人群中已有的针对流感病毒的特异性免疫反应，因此对人类的威胁最大。近年来，禽流感时有爆发，并有多例人感染禽流感病毒H5N1的报道，并且由于人群中没有针对H5N1流感病毒的预存抗体存在，人群流行病学特点表现为高病死率。禽流感的爆发和流行是公共卫生领域的重大隐患。

在抗击流感病毒的过程中，虽然有抗流感药物(如：金刚烷胺，奥斯他韦等)可供选择，但是，由于流感病毒的高变异性，抗流感药物的使用已导致耐药毒株的出现，预防和控制流感病毒爆发流行最有效的方法是疫苗免疫。

每年的流感病毒疫苗株的获得均是通过反向遗传学方法获得。现有的反向遗传系统主要由12质粒或者8质粒组成(参见如下文献：Fodor，E.，Devenish，L.，Engelhardt，O.G.，Palese，P.，Brownlee，G.G.，and Garcia-Sastre，A.(1999).Rescueof Influenza A Virus from Recombinant DNA.J.Virol.73(11)，9679-9682；该文献中文名为从重组DNA中拯救A型流感病毒；Neumann，G.，Watanabe，T.，Ito，H.，Watanabe，S.，Goto，H.，Gao，P.，Hughes，M.，Perez，D.R.，Donis，R.，Hoffmann，E.，Hobom，G.，and Kawaoka，Y.(1999).Generation of influenza A viruses entirely fromcloned cDNAs.Proc Natl Acad Sci U S A 96(16)，9345-50；该文献中文名为通过克隆cDNA产生完整的A型流感病毒。Hoffmann，E.，Neumann，G.，Kawaoka，Y.，Hobom，G.，and Webster，R.G.(2000).A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad Sci U S A97(11)，6108-13；该文献中文名为通过8个质粒产生A型流感病毒的DNA转染系统)。因为同时转染12个或者8个质粒进入同一个细胞的效率比较低，所使用的细胞株为比较容易转染的293T与MDCK混合细胞培养物，同时得到的病毒产量也不高。但是293细胞系因为含有了腺病毒的E1基因，可能会含有潜在的危险成分，目前还未被FDA批准用于流感疫苗制备。非洲绿猴肾细胞株(Vero)已经应用于多种病毒疫苗的生产，证明其安全性(可参见如下文献：Montagnon，B.J.，Vincent-Falquet，J.C.，and Saluzzo，J.F.(1999).Experience with vero cells atPasteur Merieux Connaught.Dev Biol Stand 98，137-40；discussion 167；该文献中文名为巴斯德梅里卡耐特公司关于Vero细胞的经验之谈)。并且实验证明Vero细胞可以支持流感病毒的生产(可参见如下文献：Govorkova，E.A.，Murti，G.，Meignier，B.，deTaisne，C.，and Webster，R.G.(1996).African green monkey kidney(Vero)cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses.ournal of Virology 70(8)，55 19-5524；该文献中文名为非洲绿猴肾细胞株Vero细胞可为A、B型流感病毒的宿主细胞系)。Vero细胞生产的流感病毒疫苗具有与传统鸡胚方式得到的流感病毒疫苗具有相同的免疫原性(可参见如下文献：Bruhl，P.，Kerschbaum，A.，Kistner，O.，Barrett，N.，Dorner，F.，and Gerencer，M.(2000).Humoral and cell-mediated immunity to Vero cell-derived influenza vaccine.Vaccine19(9-10)，1149-1158，该文献中文名为源于Vero细胞的流感疫苗的体液和细胞免疫反应)。因为Vero细胞比较难以通过质粒化学转染方式接受外源基因，以现有的流感病毒质粒系统在Vero细胞中得到的病毒产量很低(可参见文献：Fodor，E.，Devenish，L.，Engelhardt，O.G.，Palese，P.，Brownlee，G.G.，and Garcia-Sastre，A.(1999).Rescue of Influenza A Virus from Recombinant DNA.J.Virol.73(11)，9679-9682，该文献中文名为从重组DNA中拯救A型流感病毒)。有时候需要借助于电转化方式进行病毒拯救(可参见文献：Horimoto，T.，Murakami，S.，Muramoto，Y.，Yamada，S.，Fujii，K.，Kiso，M.，Iwatsuki-Horimoto，K.，Kino，Y.，andKawaoka，Y.(2007).Enhanced growth of seed viruses for H5N1 influenza vaccines.Virology 366(1)，23-7.该文献中文名为H5N1流感疫苗种子株的加强生长)。