[发明专利]一种新的蛇毒多肽及其制备方法和应用

说明书

发明领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种新的蛇毒多肽。

背景技术

蛇毒是毒蛇蛇腺分泌的物质，具有多种药理作用，例如镇痛、止血、抑制血栓形成和抗肿瘤等，目前已有一些蛇毒制剂应用于临床。蛇毒是成分最复杂的一类动物毒物，每一种蛇毒所含的活性成分，粗略估计至少有20种，主要包括各种酶类和毒蛋白，大部分的活性组分直接进入体内都可能使机体产生严重的毒副作用，例如心脏毒性、神经毒性等，这些毒副作用是限制蛇毒制剂在临床治疗方面应用的主要原因。

随着各种相关学科的迅速发展，对蛇毒的研究层次逐渐从粗毒水平向蛇毒组分分离纯化及其功能研究的水平深入，研究热点也逐渐从研究较为透彻的蛇毒对神经系统、血液系统的作用方面转为抗肿瘤作用及机制方面。目前，从蛇毒中分离纯化了多种具有抗肿瘤作用的组分，这些组分主要是一些细胞毒素、磷脂酶A2和解离素。

蝮蛇在我国分布广泛，蝮蛇毒的来源丰富，价格相对便宜。根据文献报道，国内的学者只从蝮蛇毒中分离了一些神经生长因子、具有抗血小板聚集的多肽，国外的学者也只是从蝮蛇毒中分离出了一种具有细胞毒作用的神经毒素，而蝮蛇毒中抗肿瘤的高纯度的有效成分暂时还比较少。

国知局于2006年7月12日授权公告了一项发明专利(CN1800208)，该专利公开了一种从蝮蛇粗毒中分离出来的具有抗肿瘤作用的蛇毒多肽，其氨基酸序列为N-GEECDCGSPENPCCD，式中字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：S为丝氨酸、E为谷氨酸、N为天冬酰胺、D为天冬氨酸、P为脯氨酸、G为甘氨酸、C为半胱氨酸，端头N表示氨基末端。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的蛇毒多肽。

本发明的另一目的在于提供一种蛇毒多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明实现上述目的的技术方案是：

一种蛇毒多肽，该多肽的N-端1～15个氨基酸为：N-EAEEDEDDDAAAANC(I)，分子量为7554Da，可由以下方法制备得到：

用水充分溶解蝮蛇粗毒，离心取上清液，在HPLC层析系统上用C18反相柱进行层析，最后冷冻干燥，得白色粉末状物质即可，其中所述的层析的过程是：以乙腈和0.1％的三氟乙酸为流动相，在温度为20～28℃下以7ml/min的流速按以下程序进行梯度洗脱120min∶0.1％三氟乙酸的洗脱梯度为100％～20％递减，乙腈的洗脱梯度为0～80％递增；洗脱到50～60分钟时收集OD_210nm为0.5～2.0的组分；

上述式(I)中字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：E为谷氨酸、A为丙氨酸、D为天冬氨酸、N为天冬酰胺、C为半胱氨酸，N表示氨基末端。

本发明蛇毒多肽须在-20℃下保存。

本发明所述的蛇毒多肽具有较好的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤的药物。

为了更好的理解本发明，下面用本发明蛇毒多肽进行体外抑制肿瘤细胞增殖实验，其结果用来说明本发明蛇毒多肽在肿瘤治疗药物领域中的用途。

采用人肝癌细胞株Hep3B为模型进行本发明蛇毒多肽的抗肿瘤活性检测。具体方法如下所述。

一、体外抑制肿瘤实验

1、实验分组

本发明蛇毒多肽治疗组：采用本发明蛇毒多肽处理，本发明蛇毒多肽制备方法见实施例1；

阳性对照组：采用蝮蛇粗毒处理；

正常对照组：正常培养，不给予任何药物干预。

2、实验方法

1)Hep3B细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心3min，细胞沉淀以10％FBS的DMEM培养基调整至5×10⁴/ml，96孔培养板每孔接种200ul，置于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

2)每组设5个复孔，每孔中加入10μl本发明蛇毒多肽，上述条件下继续培养6小时；实验重复3次。

3)细胞培养6小时后，每孔加入10μl的CCK-8(cell counting kit 8)试剂，37℃，5％CO2及饱和湿度条件下继续培养2小时。

4)用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(OD)，600nm作为参考波长，光密度越低代表存活细胞越少。