[发明专利]鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)血清1型基因工程减毒菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒的构建

将自杀性质粒pDS132与鸭疫里默氏杆菌血清1型基因ΔAcOAT分别进行Sal I单酶切胶回收，并将酶切的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶连接，得到pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒；

所述鸭疫里默氏杆菌血清1型基因ΔAcOAT由559个核苷酸组成，ΔAcOAT基因的核苷酸序列如下：

  1 GCGGTAAATA AGTAACTATG CCAATTTTCG TTATTACCGT TACAATAAAA AATTAGACCT

 61 GTTTCAATTG CCTGATCATG CAACAAGATT TCTTTAAGTA TCAAGCTCAA ACCACACCTT

121 TTGCCTCAGG TTTTGAAGCC GAAAGAGCAG AAGGAAACTA TATTTACGGA AAAGATGGCA

181 AAGCCTATCT AGACTTTGTA GCAGGAGTAT CTGCCAATAC TTTGGGACAT TCGCACCCAA

241 AAATCATCAA TGCAATTAAG GAACAGGCAG ATAAATACCT TCATATAAGG TCTATGGAGA

301 GTATGCACAA GAGAAACCTT AACATTAGGC GTATAAGTAA ATATTTGGGC GTGCCCCAAG

361 CCGAGGCTAT TCCCTAAGCT GATGGGTCGG TCTTCGGGCA GTCGCTCTTT TTTAGCCGAA

421 GCTCTCCAGT AGCTAAGCCC AGCTTTTCTC CACCTCCGAA AAAAAAGGAG CTCCAACAAT

481 GCCCTCCGCC CTCACGCAGT AAAGCTCTAA AAATCATAAG ATTTGGTCTT TAAGATTTGC

541 TAGAGTTTGT GTATATTTG；

(2)鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建

通过电转化方法将步骤(1)构建的pDS132::ΔAcOAT自杀性质粒转入鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株；

所述鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株的保藏号：CCTCC NO：M208070；保藏日期：2008年5月9日；保藏单位为中国典型培养物保藏中心。

2.根据权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株的构建方法，其特征在于：所述鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞是按下述方法制备：(1)鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株在胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上划线并培养过夜；(2)将单个菌落接种于3mL胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，37℃200rpm振荡培养4h；(3)将0.5mL振荡培养物接种于50mL胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基，在37℃200rpm振荡培养，当OD₆₀₀达到0.4时收获细胞；所述胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基预先37℃200rpm振荡0.5h；(4)将收获的细胞置于冰浴中15～30min，摇动，使内容物充分冷却；(5)将细胞转移至离心管中，4℃2600×g离心12min；(6)弃掉培养基，用80mL的10％甘油重悬菌体沉淀，4℃2800×g离心12min；(7)弃掉上清，用40mL的10％甘油重悬菌体沉淀，4℃2800×g离心12min；(8)弃掉上清，用1mL的10％甘油重悬菌体沉淀，即得到鸭疫里默氏杆菌血清1型GDGZ菌株感受态细胞。