[发明专利]一种细菌蛋白对抗生素抗性功能研究的技术方法

说明书

技术领域

本发明涉及大肠杆菌(E.coli)蛋白对抗生素抗性功能重要性研究的技术方法。

背景技术

上半个世纪以来，抗生素的使用防治了绝大多数人类传染病和非人类传染病。然而，由于人们滥用和非正确使用抗生素使得细菌产生了抗药性。抗药性细菌的产生对人类的健康造成了巨大的威胁。而耐药菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的发现和发明，因为抗生素的生产与发展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的抗性菌株出现。因此，深入研究细菌抗药性的机理，对于发明防御耐药细菌的方法和防治耐药菌具有重要的理论和现实意义。

细菌对抗生素抗性是一个多蛋白参与的事件。确定这些参与的蛋白质及其在耐药中的重要性对耐药菌的防治具有重要意义，是当前细菌耐药研究领域的重要研究方面。虽然目前通过高通量的基因芯片和蛋白质组学研究可以发现许多参与细菌耐药的分子，但由此也产生如何从这些差异蛋白质中确定其重要性的问题。这实际上成为目前基于高通量技术研究重要靶分子的瓶颈。因此，发明鉴定其中主要的关键蛋白可能对控制抗生素抗性新药的研究和开发提供直接信息，也可以为研究蛋白质抗生素抗性的重要性提供了新的技术方法。

发明内容

本发明的目的在于提供用基因缺失株传代的方法评估在抗生素抗性中细菌蛋白质的重要性的技术方法，以期为抗生素抗性新药的研究和开发提供理想的分子靶标。

本发明通过用微量肉汤两倍稀释法测定大肠杆菌蛋白缺失菌株的最小抑菌浓度测定，发现缺失TolC、OmpT、LamB或Dps后，最小抑菌浓度发生变化，而缺失FadL或OmpW后，最小抑菌浓度不变。

本发明为评估大肠杆菌这些蛋白在抗生素耐药中的作用，对上述蛋白的基因缺失株在含1/2最小抑菌浓度链霉素(3.125g/mL)的培养基中连续培养10代，获得相应的耐药菌株，并进行了最小抑菌浓度测定。结果表明与对照SM-R相比，缺失FadL后最小抑菌浓度增加4倍；缺失Dps后增加2倍；而缺失其余蛋白不变。

本发明接着将相关蛋白缺失菌株耐药菌ΔSM-R的最小抑菌浓度，分别除以相应的出发菌株ΔSM-R-O的最小抑菌浓度，得到倍数变化，结果表明与ΔSM-R-O比较，缺失蛋白TolC或OmpT后最小抑菌浓度降低2倍，缺失LamB或Dps后最小抑菌浓度增加2倍，而缺失FadL或OmpW后最小抑菌浓度保持不变，说明在耐药菌的诱导过程中，TolC、OmpT、LamB和Dps参与了耐药过程。

在选择耐药菌株时，FadL，TolC和OmpT相对于其他蛋白具有更加重要的作用。

本发明为进一步深入研究这些蛋白对链霉素的抗性作用，对上述蛋白的基因缺失株和耐药菌株在含有抗生素培养基中进行了生存能力的评价，通过对生存率分析比对，发现TolC，OmpT和Dps可能在功能上直接与链霉素抗性相关，TolC和OmpT正向参与了链霉素耐药性的产生，而Dps负向参与了链霉素耐药性的产生。这些结果证明我们发明的方法能够有效地评价相关耐药蛋白的作用。

综上所述，可以首先对大肠杆菌蛋白缺失菌株在抗生素溶液中进行传代培养，接着对这些耐药菌株及其出发菌株进行最小抑菌浓度和生存率的测定和比较研究，得出细菌在抗生素耐药性产生过程中哪些是重要的蛋白，为研究E.coli的抗生素抗性提供新的技术方法。

附图说明

图1为用肉汤稀释法测定的6种大肠杆菌蛋白缺失菌株ΔSM-R-O(ΔtolC，ΔfadL，ΔompT，ΔompW，ΔlamB和Δdps)及其出发菌株(SM-R-O)对链霉素的最小抑菌浓度

图2为蛋白耐药缺失菌株ΔSM-R(ΔtolC-R，ΔfadL-R，ΔompT-R，ΔompW-R，ΔlamB-R和Δdps-R)及出发菌株的耐药菌株(SM-R)对链霉素的最小抑菌浓度

图3为蛋白缺失菌株耐药菌与其对应的出发菌株的最小抑菌浓度的比较

图4为蛋白缺失菌株ΔSM-R-O(ΔtolC，ΔfadL，ΔompT，ΔompW，ΔlamB和Δdps)及其出发菌株(SM-R-O)对链霉素的生存率

图5为蛋白耐药缺失菌株ΔSM-R(ΔtolC-R，ΔfadL-R，ΔompT-R，ΔompW-R，ΔlamB-R和Δdps-R)及出发菌株的耐药菌株(SM-R)对链霉素的生存率

图6为蛋白耐药缺失菌株ΔSM-R与对应出发菌株ΔSM-R-O对链霉素生存率比率

图7为蛋白耐药缺失菌株ΔSM-R与对照菌株在不同浓度链霉素浓度时生存率倍数

具体实施方式