[发明专利]一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法

说明书

技术领域

本发明涉及临床医学测定方法和检测分析，特别指一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法，即采用磁性纳米技术和现代荧光免疫分析技术结合，对人类I型胸苷激酶(hTK1)血液和组织液实施准确检测的新方法。

背景技术

关于人胸腺嘧啶脱氧核苷激酶I型(hTK1)的技术背景：

人类I型胸腺嘧啶脱氧核苷激酶，中文简称为人类I型胸苷激酶；其英文名为Human thymidine kinase，简写为hTK1。DNA在合成之前，胸腺嘧啶脱氧核苷(TdR)被摄入细胞并在转化成TMP时必须经过磷酸化激酶的催化，而磷酸化反应过程必须有TK酶的催化。

正常生理状况下，人细胞中的TK主要以两种同工酶的形式存在，即hTK1和hTK2。一般地说，hTK1主要存在于细胞质中，而hTK2则主要存在于亚细胞结构的线粒体中。由于其中一种同工酶大量存在于胚胎组织，也有学者分别称它们为胚胎TK(Fetal TK)和成人TK(Adult TK)。有研究发现，胚胎TK是与细胞的分裂相关，存在于细胞质中，称之为hTK1；而成人TK存在于线粒体中，它的表达与细胞周期无关，又称之为hTK2。或者将hTK1称为细胞质胸苷激酶，hTK2称为线粒体胸苷激酶。hTK1基因定位在于染色体17q23.2-q25.3，靠近于半乳糖激酶；而hTK2基因则定位于染色体16q22-q23.1。

事实上，在上个世纪80年代已有学者完成了hTK1基因编码区域的cDNA分子克隆及其序列分析。研究表明，TK1全酶分子量为96000道尔顿，其分子结构为四聚体，等电点聚焦免疫电泳测得其等电点为8.3-8.5。TK1的四聚体中每一单体α螺旋/β折叠区域组成与ATP酶家系类似，其p-环是TK1酶活性调节区域，即底物反应区域。四聚体中β折叠区域有一锌原子与β折叠区域连接。在这β-丝状带折叠的底部，干链变宽成为一个套索闭环，是dTTP负责TK1活性反馈抑制调节的的区域，但TK1这套索环结构是不同于其它脱氧核苷酸激酶。

hTK1是存在于机体中的重要激酶之一，它作为一种胸苷参与DNA合成的关键激酶，能可逆性催化胸腺嘧啶脱氧核苷与磷酸脱氧核苷之间的转化，并真实而客观地反映着细胞的增殖状况。正是由于hTK1与细胞分裂密切相关，在细胞分裂G1期含量较低，到S期后逐渐升高，至G2期达到最高，因此，编码hTK1的mRNA及其所表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。可以说，TK1水平的高低与DNA在细胞周期的S期DNA合成速度密切相关。一般情况下，所观察到正常增殖细胞TK1的水平在细胞周期的G1和S期交界处开始升高，随着细胞进入G1晚期，TK1酶的水平逐渐急剧上升，直至S和G2期交界处，但在肿瘤细胞中，这种高TK1水平从S晚期一直持续到M早期。大量离体试验结果表明，TK1在增殖细胞和肿瘤细胞周期调控代谢过程具有特殊的意义。通常，一些非增殖细胞的TK1和健康人血清和组织中TK1，其含量极微或检测不到，而在异常增殖细胞或恶性肿瘤患者中，TK1酶伴随着肿瘤细胞数的急剧增殖而升高。不同来组织增殖细胞中细胞周期与TK1信使RNA(TK1mRNA)的表达关系是复杂的，mRNA的剪切和翻译也是随细胞生长状态变化的，推测TK1水平主要是通过翻译后调控机制发挥作用。而且，已有研究表明，增殖细胞生长的不同时期，TK1活性的调控则主要是通过dTTP反馈抑制途径和底物循环方式进行调节的。