[发明专利]一种筛选肿瘤遗传分子标记物的方法

说明书

技术领域

本发明属肿瘤分子遗传学领域，尤其涉及肿瘤遗传分子标记物的筛选。

背景技术

人体局部组织发生癌变后，在其组织形态学逐步改变的过程中，癌变细胞中会有不同的基因(或基因群)及其表达产物随之产生变化，如果能检测到这些分子构成方面的变化，筛选出与肿瘤遗传相关的分子标记物，则无疑能对肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效监测提供巨大帮助。

在不同的肿瘤组织中筛选出一些起关键作用的基因或基因群，筛选出用于肿瘤早期诊断、分子分类、疗效检测、预后判断等方面的分子标记物，正是当前肿瘤遗传学上积极探索的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选肿瘤遗传分子标记物的方法。

本发明通过以下详细技术方案实现：(1)对肿瘤组织标本和非肿瘤组织标本进行显微切割；(2)纯化组织标本，提取纯化组织标本中的RNA；(3)体外转录、线性扩增合成aRNA，aRNA再经逆转录、二轮体外线性扩增制备生物素标记cRNA探针；(4)探针经片段化后与人类全基因组表达谱芯片杂交，信号扫描，输出数据，构建肿瘤纯化组织的基因表达谱；(5)运用weightedvoting算法，使用leave-one-out cross-validation对数据归一化处理，筛选与肿瘤发生、发展过程相关的分子标记物。

本发明结合使用基因芯片、显微切割、线性扩增技术，构建并研究不同病理类型、不同临床分期的肿瘤组织中肿瘤基因表达谱，为筛选出不同用途的肿瘤分子标记物和潜在的肿瘤药物作用靶点提供了一种新的方法。

同时本发明结合RNA保护以克服组织中RNA降解，采用显微切割以获得纯净的癌细胞，利用线性扩增技术解决了RNA量少问题。并且，结合现代生物信息学技术和统计学分析，从海量信息中去伪存真，通过信息分析、比对，从多种病理类型、不同临床发展阶段肿瘤组织中筛选出起关键作用的基因。

附图说明

图1：本发明的流程示意图。

具体实施方式

下面以鼻咽癌遗传相关分子标记物的筛选为例，详细说明本发明的具体实施。

实施例1：筛选鼻咽癌分子标记物

(1)收集、保存、显微切割、纯化鼻咽部组织标本

①组织标本的收集保存过程：门诊收集鼻咽癌标本和鼻咽炎性上皮组织标本34例。组织标本分为2份，一份固定于10％甲醛溶液中送病理科获得病理诊断书；一份保存于RNAlater RNA Stabilization Reagent。贮存于-20℃用于显微切割、组织RNA提取。具体RNAlater RNA Stabilization Reagent存储组织标本程序为：普通1.5ml塑料试管经灭活RNA酶处理，每管预置1～1.5mlRNAlater RNA Stabilization Reagent-20℃冻存备用，鼻咽部活检组织标本离体后，立刻以生理盐水冲洗血迹，10min内浸入到RNAlater RNA StabilizationReagent中，-20℃冻存。

②组织标本的显微切割与纯化过程：普通载玻片和染色盒经自来水清洗，双蒸水冲洗后放入0.1％DEPC水中浸泡8小时，随后180℃干烤3小时，置-20℃冻存备用。将Leica CM 1800冰冻切片机预冷至-20℃，RNAlater RNAStabilization Reagent-20℃冻存组织标本及RNA酶灭活载玻片以冰盒转至冰冻切片机箱。组织块上柱，调整切片刀，将切片控制在15～18μm之间，直接贴敷在预制的载玻片上。根据组织切片的大小，每载玻片可以粘贴4～8切片不等。将粘贴好组织切片的载玻片放在位于冰冻切片机箱的预制染色缸中，冰盒转移至实验台，进入下一步组织切片固定、染色试验阶段。无水乙醇中加入DEPC水配制梯度酒精，浓度分别70％、95％和100％。冰盒中取出切片，切片染色顺序如下：70％酒精5min→95％酒精2min→无水酒精2min→苏木素染色5min→DEPC水洗3min→70％酒精5min→0.5％伊红酒精溶液染色30s→70％酒精2min→95％酒精2min→无水酒精保存。改良ONO-121Ergonomic Joystick Micromanipulator系统，无菌注射针头作为显微切割刀具，借助移动架协助固定，倒置正像显微镜下首先分辨出癌巢或粘膜柱状上皮区，镜下移动针头，将目标组织块切下，置于无水乙醇中立即转入RNA提取。

(2)肿瘤组织标本的RNA提取纯化