[发明专利]用于多种肿瘤抑瘤基因检测的cDNA芯片

说明书

技术领域

本发明涉及生物芯片，尤其涉及DNA芯片。

背景技术

3号染色体短臂的杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)是包括鼻咽癌在内多种肿瘤中的常见事件，其中又尤以3p21区域LOH频率为高。根据Knudson的“两次突变”学说，某一抑瘤基因经胚性突变以野生型/突变型的杂合状态传给子代，然后通过细胞有丝分裂过程中的突变，转为半合性(野生型等位基因丢失)或纯合型(突变/突变型)，致使正常抑瘤基因不再表达，就可导致肿瘤的发生。如果抑瘤基因的突变或多态性等位基因型，如单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms/SNP)存在家族与人群聚集性，可显著提高患肿瘤的风险，该基因即为肿瘤遗传易感基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于多种肿瘤抑瘤基因表达检测的cDNA芯片，利用该芯片，能够同时检测从正常组织到癌变组织的多个基因表达水平的变化，能开展肿瘤多基因表达的动态研究。

本发明的芯片包括基片及固定于基片上的cDNA探针，所述cDNA探针由从人类染色体3p上选取的如表1所述的288个基因，以及对照点探针组成。

本发明在对照探针的选择上，可以选择看家基因作为阳性对照。

由于本发明中所选取的288个基因都是与多种肿瘤密切相关的抑瘤基因，因此，利用本发明的芯片能同时检测从正常组织到癌变组织的和多种肿瘤密切相关的多个基因的表达水平的变化。与现有的单个基因功能研究相比，利用本发明的芯片，能开展肿瘤多基因表达的动态研究，它简化了基因表达检测的过程，节约了实验时间和实验成本。与全基因组表达谱芯片相比，它针对性更强，缩小了多种肿瘤抑瘤基因筛选的范围，在筛选多种肿瘤抑瘤基因方面具有更大的实用价值，同时节省了大量的人力、财力和物力。

具体实施方式

实施例1：本发明芯片的制备

1.克隆如表1所述的288个基因，各基因符号和gi号见表1。具体克隆过程为：

(1)收集人胚来源的人胚鼻咽、胃、食管、肺、肝、心、脾、肌肉、肾、皮肤等组织，液氮保存。用Trizol试剂盒提取成人胚胎鼻咽、胃、食管、肺、肝、心、脾、肌肉、肾、皮肤总RNA，混合各组织RNA样本。把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol试剂(Trizol试剂加入量为1ml/100mg组织)，裂解组织，冰上放置5min。吸入1.5ml离心管中，加入氯仿(氯仿加入量为0.2ml/ml Trizol)，冰上放置5min。10000×g离心15min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10min。10000×g离心15min，去上清，70％乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。

(2)用DNase-I消化RNA中痕量的DNA：反应体积100μl，总RNA 10μg、DNase-I 10u、RNasin 200u、Tris.Cl(pH 8.3)10mM、MgCl₂ 10mM，37℃，1h，等体积苯酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，RNA溶于DEPC处理的水中。

(3)为288个基因设计引物：以基因的mRNA序列的3’末端设计引物。以人胚各组织混合的RNA为模板，进行PCR扩增，胶回收目的片段。PCR条件为：94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸50sec，进行35个循环，以达到富集表达片段。取8μl PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测。上海华舜公司的胶回收试剂盒回收PCR产物，每个基因片断回收20管50μl PCR产物。PCR产物割胶纯化后直接测序验证，并输入NCBI/Blast进行序列匹配，保证PCR序列的唯一性。

2.点制芯片：

288个基因克隆产物重复两次点样，37个看家基因(参见表2)作重复点样两次作为74个阳性对照点，以未加DNA的点样液作为16个空白对照点。用点样仪在基片上进行点样，基片可以是各种用于作为生物芯片的片基，如玻片或塑料片，在本发明的实施中采用硅烷化玻片。点样后玻片经水合2h、室温干燥0.5h，UV交联，再分别用2g/L的SDS、水及2g/L硼氢化钠处理10min，晾干，即制得本发明的芯片。

表1作为本发明芯片探针的3p段上的288个基因