[发明专利]一种同时提取堆肥样品中PLFA和DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及堆肥样品中微生物的PLFA和DNA的混合提取方法。

背景技术

微生物是堆肥化处理的重要因素，要使其更有效的降解有机物以控制堆肥过程，提高堆肥效率，研究堆肥过程中各种微生物的数量、组成及其相互作用进行了解是有必要的。由于大部分环境微生物都处于存活不可培养状态，使得了解微生物实际群落结构比较困难。近年来核酸分析和脂质分析都力图克服这一难点，这些方法都具有能从环境样品中直接提取活的细胞组分以用于分析的优点。

PLFA(Phospholipid fatty acid)谱图分析法是生物化学方法的代表。磷脂是构成活体细胞膜的重要组成部分，不同的微生物具有不同的PLFA种类和数量。PLFA分子中的首官能团和侧链通常因微生物的类型异而异，因此每种样品具有独特的PLFA谱图，不同菌种的PLFA谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群中不同群体的标记物。PLFA谱图发生变化更多的是源于样品中的微生物的组成和生物量发生变化，生物体内细胞中的磷脂含量通常可认为是相对显著恒定的。由于PLFA谱图分析法能较完整提供活微生物的生物量信息及PLFA分子隐含微生物类型信息，PLFA谱图分析法通常用于估算微生物生物量和确定微生物的群落组成。DNA的提取是分子生态学研究的基础工作。不同的微生物种群有不同的DNA序列或长度，分子量相同的DNA片段其序列可能不同。从DNA指纹图的变化中可以寻找重要功能菌群的基因组序列信息，结合分子克隆和探针杂交等手段还可以实现功能菌群的分离，用于研究复杂微生物生态系统的结构和动态变化，为优化种群结构、调节系统功能和发现新的重要微生物功能类群提供了可行的途径。

在研究堆肥样品这样的复杂微生物群落结构和群落动态时，采用一种方法是不够的。若将不同方法的组合应用可以取长补短，避免了由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差，因此，将各种方法组合应用已成为分析堆肥微生物群落结构变化的一种趋势，但是，PLFA法和核酸分析法，都要求从堆肥样品中提取代表生物信息的物质，且提取步骤都比较繁琐，提取方法的结合为方法的组合应用提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种能同时提取堆肥样品中PLFA和DNA的方法，本方法准确、高效，并且所需样品量较少。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

a.PLFA的提取

a-1.称取堆肥样品于试管中，分别加入二氯甲烷、甲醇、磷酸盐缓冲溶液，依次加入的体积比为1∶2∶1；

a-2.超声匀化后低温避光静置过夜；

a-3.将上述试管离心分层，液相转移到新的玻璃管中，加入二氯甲烷和纯水，使得二氯甲烷∶甲醇∶磷酸缓冲液的体积比为1∶1∶0.9，用于继续提取PLFA，固相于-20℃下保存以提取DNA；

a-4.将上述液相静置24h后，转移水相于新的离心管a中用于沉淀DNA，将有机相过滤，去除可能残留的颗粒悬浮物，滤液用N₂干燥后加正己烷溶解；

a-5.将上一步正己烷溶解的脂质过硅胶柱，依次用正己烷、氯仿、丙酮、甲醇洗涤柱子，收集甲醇洗涤液，N₂干燥；

a-6.用甲醇和甲苯混合溶液溶解干燥后的脂类物质，所述混合溶液中甲醇∶甲苯的体积比为1∶1，加入KOH溶液水浴加热使其甲酯化，冷却至室温，加入醋酸中和过量的KOH，摇匀后加氯仿萃取，去水相，再加去离子水洗涤，使得有机相部分的无机物尽可能的溶解在水相，底部有机相为溶解在氯仿中的甲酯化PLFA；

b.DNA提取

b-1.取步骤a-3中所保存的固相物质，添加磷酸盐缓冲液洗涤去除样品中的腐殖酸；

b-2.样品洗涤后添加DNA提取液和蛋白酶(Proteinase)K进行消化，其中，样品量∶DNA提取液∶蛋白酶K为1g∶1ml∶0.005ml；

b-3.将上一步所得物质转移至离心管b中，并加入SDS，另外在步骤a-4中的离心管a中也加入SDS，两根离心管同时水浴消化细胞中的蛋白质，然后将含固相的离心管b离心分层；

b-4.收集离心管b中的上清，转移到离心管a中，轻微混合；

b-5.加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液至离心管a中，所述混合溶液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1，轻微颠倒混合后离心，吸取水相转移至新的离心管中；

b-6.上一步水相中加入0.6倍体积异丙醇沉淀1h，然后离心；

b-7.沉淀以冰预冷的乙醇重复洗涤后风干；

b-8.加入TE缓冲液溶解DNA并置于-20℃下保存；