[发明专利]猪蓝耳病病毒RT－PCR快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域的诊断技术，具体是一种检测猪蓝耳病病毒的诊断方法和专用试剂盒。

背景技术

猪蓝耳病，也称为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)引起的一种猪的传染病，其临诊特征为各种年龄的猪均可感染，病猪厌食、嗜睡、体温升高，妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎，种公猪性功能下降，仔猪和育肥猪呼吸障碍。其特征性病理变化为间质性肺炎，皮肤发绀。1987年该病首次报道于美国，随后迅速蔓延北美、欧洲及亚洲各国，目前也是我国最主要的猪群疫病之一。PRRS与其它引起猪繁殖障碍的疾病存在着非常类似的临诊症状，没有示病性临床症状，根据临床症状进行诊断及鉴别诊断比较困难。实验室诊断方面，国内外已建立了一些常规的检测方法，如病毒的分离与鉴定、间接ELISA、IPMA、IFA及Dot-ELISA等血清学方法用于该病诊断。在这些诊断方法中，特异性、敏感性、操作技术等方面存在各种各样的问题，不能满足生产需要。由于该病特殊的免疫机理，疫苗免疫效果的不确定性，对养猪业的威胁将时长期存在，因此，淘汰病原学阳性猪是该病防疫中主要措施，建立病原学快速检测技术非常重要。

发明内容

本发明根据猪蓝耳病病毒(PRRSV)美洲型标准毒株((ATCC VR-2332)的ORF6及部分ORF7的序列，设计一对猪蓝耳病病毒特异性扩增引物，结合先进的病毒核酸提取技术和高效RT-PCR商品试剂，经实验条件优化，组合而成的一种成熟的一步法RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒能对待检组织进行直接检测，检测过程简单，抗污染性强。从病料处理到获得结果只需4小时，结果准确且灵敏度高、特异性好，是目前猪蓝耳病病毒检测方法非常好的一种替代方法。

本发明的主要技术方案有：

1.引物设计：根据猪蓝耳病病毒(PRRSV)美洲型标准毒株((ATCC VR-2332)的ORF6及部分ORF7的序列，设计一对猪蓝耳病病毒特异性扩增引物，引物详细为：

Primer P1：5’-CACTACGGTCAACGGCACAT-3’

Primer P2：5’-CCACAGTGTAACTTATCCTCCCT-3’

其中PrimerP1/P2引物对在猪蓝耳病病毒核酸中特异性扩增出402bp的产物。

2.待检病料的核酸提取：采用RNA快速提取方法提取待检组织样品的RNA核酸。

3.RT-PCR体系：AMV/Tfl 5×Reaction Buffer 2.5μL，25mM/L MgSO₄ 1μL，10mM/L dNTP0.5μL，AMV Rever Transcriptase 2.5u，Tfl DNA Polymerase 2.5u，20uM/L Primer P1 1μL，20uM/L Primer P2 1μL，待检RNA模板5μL，加水至总体积25μL。

4.RT-PCR程序：45℃逆转录45min；94℃预变性2min；94℃30s、55℃45s、68℃45s，

35个循环；最后68℃延伸8min。4℃保存。

本发明试剂盒组成及保存

Sloution R2        6mL×1   管室温储存

Wash buffer        12mL×1  管室温储存

Elution buffer     1mL×1   管室温储存

Spin columns       10个室温储存

RNase Free离心管   20个室温储存

RT-PCR体系         20μL×10管     -20℃储存，避免反复冻融。

阳性对照           1mL×1管        -20℃储存，避免反复冻融。

RNase Free H₂O     1mL×1管        -20℃储存

本试剂盒有效期6个月。

本发明的优点

1.操作简单，抗污染性强，耗时短。本方法采用了先进的病毒核酸提取技术，操作简单，可操作性强，并省去了以往抽提核酸过程中的多步骤、多试剂抽提，从而减少了污染，保证了检测结果的准确度；同时，采用的高效RT-PCR商品试剂，实现了一步法检测，比常用的二步法RT-PCR省时省力，同时也避免了二步法RT-PCR过程中加样所造成的PCR污染。