[发明专利]一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根及其培养技术

说明书

技术领域

本发明涉及中药。具体涉及一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根SmHr1及其培养 技术。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是常用中药，其药用部位为根。丹参及以丹参为 主的中药制剂是临床治疗心血管系统疾病的首选药之一。除用于饮片外，丹参还是复方 丹参滴丸、复方丹参片、丹参注射液等很多种中成药的主要原料。

丹参的主要活性成分有丹参酮等二萜醌类化合物和丹酚酸等水溶性酚酸类化合物。 丹酚酸类化合物的药用价值越来越受到重视，目前已分离的丹酚酸类化合物有二十几 种，均具有很强的抗过氧化和清除自由基的功能。丹酚酸B镁盐作为抑制肝纤维化和 肝硬化的二类新药已获得中国国家专利；以丹酚酸B为主要成分的注射用丹参多酚酸 盐作为治疗冠心病和心绞痛的药物效果显著；此外，丹酚酸在治疗脑血管病基础与临床 研究中表现出独特的作用效果启示：丹酚酸有望成为抗脑缺血理想药物。由此可见，丹 酚酸作为治疗肝病、心血管疾病和抗脑缺血的有效药物进入临床使用，对丹酚酸原料的 需求将会迅猛增加。

若单纯依赖丹参的大面积栽培来提取丹酚酸类化合物，不仅占用了耕地，也增大了 提取成本。因此，怎样应用中药生物技术，利用丹参毛状根提高和生产丹酚酸类药用资 源，是缓解药材资源压力的有效途径。另一方面，这样对降低丹酚酸制剂的生产成本、 提高制剂质量也具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是研究设计能获得稳定产生多种酚酸类化合物的丹参毛 状根株系，提供高含量丹酚酸制剂的生产原料。

本发明提供了一种高含量多种酚酸类化合物的丹参毛状根SmHr1。该毛状根(Hairy root)是本发明人首次由发根农杆菌侵染丹参叶片诱导获得，因其来源于丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)，故命名为SmHr1。丹参毛状根SmHr1在固体培养基和液体培养基 中均呈褐色毛发状，固体培养时形态略粗壮。其生长失去向地性，且能在不添加任何激 素的MSOH固体培养基及MSOH液体培养基(配方见实施例1)中持续稳定生长繁殖。 并能稳定合成多种丹酚酸类化合物。

本发明的另一目的是提供了上述丹参毛状根SmHr1的培养方法。

该方法包括下列步骤：

(1)应用YMB液体培养基培养的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogensis)侵染野 生型丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)叶片，在MSOH固体培养基中进行培 养，以筛选获得丹参毛状根SmHr1；

(2)将毛状根SmHr1在MSOH固体培养基(配方见实施例1)，25℃，黑暗静置 培养3～5周后，选取长势较为粗壮鲜嫩的毛状根转接到MSOH液体培养基(配 方见实施例1)中25℃，黑暗，120rpm水平回旋振荡培养2～4周；再选取 长势良好的毛状根转接到MSOH固体培养基中培养；如此反复，进行3～5次 交替继代培养，筛选到在MSOH液体培养基中生长快速、遗传稳定、并能稳 定产生多种酚酸类成分的丹参毛状根株系SmHr1；

(3)应用持续液体继代培养(即液体培养基中培养的毛状根转接到液体培养基持 续培养的方法)、接种14天后在培养基中添加茉莉酸甲酯，使其终浓度为5～ 30μM，提高丹参毛状根的生长量积累及药用成分丹酚酸类化合物的含量。

YMB液体培养基组成(g/L)

Manitol         10

Yeast Extract   0.4

NaCl            0.1

MgSO₄·7H₂O     0.2

K₂HPO₄          0.5

用NaOH和HCl调pH至7.2后于121℃高压灭菌。

MSOH固体培养基组成(mg/L)

(1)大量元素

KNO₃           1,900

CaCl₂·2H₂O    440

MgSO₄·7H₂O    370

KH₂PO₄         170