[发明专利]胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法

说明书

技术领域

本发明是药物残留检测方法，应用免疫化学和免疫学原理，通过胶体金的免疫反应再借助免疫层析技术达到检测低浓度药物残留目的，应用于快速检测食品和饲料中的药物残留。

背景技术

时常摄入含兽药、农药或毒物残留食品，对人危害可想而知，例抗生素可使某些菌株产生耐药性，耐药菌株又能将耐药因子传递给其他敏感细胞，使其他异种菌株变成耐药菌株，导致人体对抗生素的耐药性，如长期食用抗生素残留的食物，使菌群平衡失调或引起核黄素缺乏症和紫癜性损伤，也会造成三致(致畸、致癌、致突变)。牛乳中抗生素的残留量达到相当水平，还会引起酸奶发酵失败，给乳品工业带来严重损失，由此在种植、养殖、饲养、牧业食品加工等生产领域建立快速准确检测食品中药物残留相当迫切。目前主要检测方法有微生物培养法，酶联免疫法，色谱法和胶体金层析法，微生物培养法敏感度低，重复性差，时间长；酶联免疫法和色谱法需用设备、耗时且必须专业人员和实验室才能完成；胶体金层析法，快速简便，此方法把标记抗体的胶体金颗粒包被在多孔疏松支撑物后干燥，检测时样品流经多孔疏松支撑物并将包被标记的胶体金颗粒从多孔疏松支持物溶解下来，同时样本中抗原(药物残留)、包被硝酸纤维素膜上的完全抗原和胶体金标记的抗体进行免疫竞争反应，由于这种免疫竞争反应在溶解和层析过程中同时进行，显然存在以下问题，一是在短时间内标记胶体金从支撑物上溶解不彻底，以致免疫反应不完全；其次样品中被测抗原和包被硝酸纤维素膜上抗原几乎同时竞争标记抗体，这种时间差小影响了检测灵敏；再支撑材料的组织不均匀影响液体的毛细吸现象导致层析均匀不理想等诸多因素造成此法检测灵敏度下降，因此很难通过胶体金免疫竞争层析法检测到ppb级残留。

本发明克服胶体金免疫竞争层析法的缺陷，采用将标记好胶体金抗体包被在类似酶联反的容器(微孔条筒)内，检测时先将被测样品和包被在容器上标记胶体金颗粒溶出，样品中的抗原(药物)同时和标记抗体进行充分反应，然后把此反应液滴加到已包被完全抗原的试条上免疫层析反应。这样解决了胶体金层析法反应时间短、溶解不充分、免疫结合不完全等造成检测灵敏度低的问题，使检测灵敏度显著提高，例用同样原料制成胶体金层析法试剂和本发明方法制成的试剂，检测乳品中相应药物残留，前者青霉素检测到30-40ng/ml，氯霉素10-20ng/ml，四环素300-400ng/ml，后者分别为3-6ng/ml，0.3-1.0ng/ml，50-100ng/ml，显然后者能达到规定要求，由于此方法兼胶体金层析法的优点，快速、简便、准确，此类试剂适合现场快速检测，也为家庭食品安检提供手段。

发明内容

胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法是，将标记好胶体金加入类似酶联反的容器(微孔条筒)里抽干，检测时先将被测样品加入此容器并将在容器(微孔条筒)内的胶体金颗粒溶出，然后将混合液滴加到已包被相应的完全抗原的试条或试卡上进行免疫层析反应。整个检测过程分二步进行，即免疫结合和免疫竞争，由于这个特点，所以反应充分，灵敏提高，此方法操作简便，检测是特异性抗原抗体反应，所以具有特异性强、准确性高的特点。

本发明方法是通过以下技术方案和工作原理实现的。特异性抗体标记在胶体金颗粒或彩色乳胶颗粒上，标记物加到容器内抽干，标记物便附着在容器内壁上；将相应完全抗原(药物-BSA结合物)包被并固定硝酸纤维素膜的检测区(T)上，硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，始端有供加样用的滤样垫玻纤，末端有供助层析用的吸水纸组成试条，或将试条镶嵌入塑卡中，组成试剂。检测时，先将被测样品加入微孔内，把附着在容器壁上的胶体金颗粒溶出、充分混合，同时如被检测样本含有相应的抗原(药物)与标记的胶体金颗粒结合发生免疫反应，此反应液再滴加到试条的加样滤样垫玻纤上进行免疫层析，由于被测样本中相应的抗原(药物)和复溶的金标记抗体发生了免疫反应，此时混合液层析到检测区上时包被抗原无法竞争到标记抗体，检测区内没有出现反应线，即阳性，相反如被测样本没有被测抗原(相应药物)，则标记的抗体层析到检测区时和包被膜上的抗原结合形成紫红线，即阴性。为了证明试剂有效性和易判读，分别在质控区(C)包被羊抗兔IgG为质控线，所以不管结果怎样质控线C始终出现。

应用本发明方法制成的试剂由五部分组成：硝酸纤维素膜、吸水纸、滤样垫玻纤、PVC底板和容器。

硝酸纤维素膜是含有包被在检测区(T)上对应完全抗原(相应的药物-BSA结合物)的检测线，和质控区(C)羊抗兔IgG质控线。

吸水纸贴有印有对应测试药物的名称，方便用户辨认品种。

滤样垫玻纤是用缓冲液处理过用于调整样品pH值的特定滤样垫玻纤。