[发明专利]一种含有整合子的工程菌株

说明书

技术领域

本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及一种含有整合子的工程菌株。 

背景技术

据报道，目前临床治疗中，细菌的耐药性非常严重，尤其是多重耐药菌株的出现是对临床细菌感染性疾病治疗的一个巨大挑战。人们预料可能由于基因突变会导致耐单种抗生素的菌株的出现，但在同一菌株中同时出现对多种抗生素的耐药性，很难用基因突变进行解释。研究证明，遗传物质在菌种内以及菌种间的水平传播，是细菌获得新的耐药性的重要途径。耐药性快速广泛地传播以及在不同菌种间出现非常相似的耐药方式，说明了上述机制的重要性。近来的研究表明整合子在耐药基因的水平传播以及多重耐药菌株的出现中起重要作用。通常一个整合子至少包括三个最基本的元件：编码属于酪氨酸重组酶家族的整合酶的基因，位于整合酶编码区而与整合酶编码方向相反的驱动下游基因盒表达的启动子Pc，整合酶所识别的重组位点attI。现有技术揭示了基因盒由一个通常无启动子的开放读码框和3′端整合酶重组识别位点attC构成。有调查对一组来自社区并且至少在一个月未服用抗生素的健康人群进行研究，所分离到的大肠杆菌中整合子的出现频率为15％。Jones等人的研究表明携带有整合子的菌株要比不携带整合子的菌株更容易产生对多种抗生素的耐药性。到目前为止，研究已发现70多种耐药性基因盒。以上说明整合子在耐药性的水平传播上具有重要的意义。 

整合子在某些情况下通过捕获有利的基因盒，如耐药性基因盒，而获得生存优势，但也有可能捕获某些对宿主产生毒性的基因盒而造成不利的影响，或者过度捕获基因盒而对宿主菌的繁殖造成一定负担。因此，细菌的整合子在捕获外来基因盒的过程中，推测其一定有一套完整而又精细的调节机制，但这一机制还仍未明了。对上述有关调节机制的研究，将有利于揭示细菌的耐药性，尤其是细菌的多重耐药性。 

发明内容

本发明目的是为克服现有技术的不足，提供一株含有整合子的工程菌株。 

本发明采用序列1的整合子插入到大肠杆菌DH5α基因组DNA中建立含有整合子的工程菌株。所述工程菌株已于2008年1月18日保藏，保藏单位：CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.2353，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia.coli)。该菌株命名为DHS。本工程菌株具有以下生物学特性： 

所述工程菌株染色体DNA上含有序列1的结构(图1)，能够捕获基因盒。 

所述的捕获的基因盒为编码链霉素抗性筛选标记的基因aadA2(以下称：aadA2)耐药性基因盒。 

本发明的工程菌株采用下述方法建立： 

采用转座子作为工具，将已知序列的整合子克隆到转座子构建载体获重组质粒，以此重组质粒为模板利用PCR扩增含有整合子的转座子，该转座子与转座酶混合形成转座复合体，采用电穿孔法将该复合体转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，利用反向PCR技术确定整合子在大肠杆菌染色体DNA上的插入位点。通过下述步骤： 

1)将序列1(图1)的整合子克隆到转座子构建载体，获重组质粒； 

2)上述重组质粒为模板用PCR扩增含有整合子的转座子； 

3)步骤2的PCR扩增产物与转座酶混合形成转座复合体，采用电穿孔的方法将该复合体转化大肠杆菌DH5α； 

4)筛选阳性克隆，利用反向PCR技术确定整合子在大肠杆菌染色体DNA上的插入位点， 

所述的插入位置位于整合子的attI位点，在大肠杆菌染色体DNA的3724784---3724792(GenBank accession number：U00096.2)位置插入一段含有整合子的DNA片段。 

附图说明

本发明建立的已知遗传背景的大肠杆菌染色体DNA中含有已知序列的整合子的工程菌株，可为宿主菌在整合子捕获耐药性基因盒的调控机制的研究建立良好的实验平台，有利于耐药性的水平传播机理的深入研究。该株细菌便于进行有关的分子生物学技术操作，如容易进行有关质粒的转化和所研究基因的表达。 

图1是插入到大肠杆菌DH5α的一段含有整合子DNA序列图， 

其中，方框内的碱基表示转座酶所识别的重组序列，阴影部分表示整合酶编码序列，黑体部分表示编码对甲氧苄啶(TMP)耐药性的DHFR基因，斜体部分为功能未知的ORFF部分序列，垂直箭头表示基因盒在整合子的attI位点发生重组时的具体插入位置。 

图2是DHS菌株捕获aadA2基因盒后的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果，