[发明专利]测定血清总肉碱的试剂

说明书

技术领域

本发明涉及用定量检测总肉碱(TOTAL CARNITINE，简称TCar)的方法，具体涉定量检测总肉碱(TOTAL CARNITINE，简称TCar)的试剂。

背景技术

肉碱是介导脂肪酸通过线粒体膜进入线粒体进行β-氧化产生供肌肉和其它细胞代谢所需能量的重要的辅因子。它是一种人体中天然存在的类维生素营养物质。其主要功能是转运脂肪进入线粒体，促进脂肪酸燃烧，为机体提供能量。通常情况下，肉碱缺乏会导致骨骼肌和心肌紊乱，因为这两种肌肉都是高能耗的组织。检测肉碱的含量可以对于和此组织相关的疾病进行诊断和治疗支持。此外肾病和透析病人的肉碱会出现代谢紊乱情况，对肉碱进行监测可以对临床措施的采取提供支持，此外，一些关于肉碱的临床意义还再发现中。

目前已报道的测定方法有高压液相色谱(HPLC)法和质谱(MS)法等，多数敏感度不够。有的需要使用放射性同位素，易造成放射性污染。有的方法复杂，需时较长，不能适应临床常规使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定血清总肉碱的试剂，以克服现有技术存在的上述缺陷。

技术原理：标本中的酰基肉碱在酰基肉碱酯酶(ACE)作用下转化为肉碱，肉碱在β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD⁺)氧化型存在下被肉碱脱氢酶(CDH)特异性的氧化成脱氢肉碱，同时β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD⁺)氧化型转化成在β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)还原型。而脱氢肉碱在β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)存在下被肉碱脱氢酶(CDH)特异性的还原成肉碱，同时β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)也转化成β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD⁺)。如此肉碱和脱氢肉碱Thio-NAD⁺和NADH的存在下通过CDH进行酶循环反应导致Thio-NADH的不断累积，达到平衡后，Thio-NADH的生成量和样本中的肉碱的浓度呈一定比例，从而可以通过测定Thio-NADH的生成速度进行标本的游离肉碱定量。并且，Thio-NAD⁺和NADH可参与上述循环反应直到枯竭状态，灵敏度非常高。

本发明的试剂，为含有如下浓度的组分的缓冲溶液：

Thio-NAD⁺  0.001g/L～10g/L

酰基肉碱酯酶(ACE)  0.1KU/L～50KU/L

NADH  0.01g/L～10g/L

肉碱脱氢酶(CDH)  0.5KU/L～500KU/L

所说的缓冲溶液没有特别限制，可以是三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐、GOOD’S等常规缓冲剂，pH为4～9；

优选的，本发明的试剂中，除了上述必要组分外，还可以包含防腐剂、螯合剂、稳定剂、表面活性剂或蛋白酶抑制剂等；

所说的防腐剂可以是常用的叠氮钠(NaN₃)、硫柳汞、proclin系列、庆大霉素、氯霉素等抗生素或阳离子类表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化氨或十四烷基三甲基溴化氨；

所说的稳定剂可以选择牛血清白蛋白(BSA)、多羟基醇、氨基酸、金属离子、螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、表面活性剂或蛋白酶抑制剂，如蛋白酶抑制剂PMSF(对甲基磺酰氟)、抑肽酶、植酸、硼酸盐等，浓度没有特别限制，只要不影响正常的反应测定即可，优选的浓度为0.1～5g/L；

本发明的试剂，可以双试剂，即将试剂分为试剂(R1)和试剂(R2)，也可以将所有组分配在一起形成单试剂，也可以配成2个以上的部分形成多试剂，但以双试剂方式为佳。试剂可以以液体的形式出现；也可以采用先配成液体然后再冷冻保存，使用前解冻成液体使用；也可以制成冻干品保存，使用前用水或一定的缓冲液溶解后再使用。

所说的双试剂中，试剂(R1)的组分为和含量为：