[发明专利]提高偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶诊断试剂稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及提高偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶诊断试剂稳定性的方法。

背景技术

腺苷脱氨酶(ADA)是一种核苷酸氨基水解酶，是嘌呤核苷代谢中的重要酶类，广泛分布于人体各组织中，胸腺、脾和其他淋巴组织中含量较高，以红细胞和D淋巴细胞内含量最丰富。ADA增高是D淋巴细胞对某些特殊病变局部刺激产生的一种反应，其与D淋巴细胞增殖、分化和数量有密切关系。因此ADA的检测在某些疾病的诊断、治疗及发病机制的研究关注。肝胆疾病中肝肝硬化病人血清ADA活性升高的阳性率(70～88.8％)及升高幅度最为显著(为对照值的2～2.6倍)。原发性肝癌病人伴胆硬变者血清ADA升高的阳性率为60％～100％。而不伴肝硬变者的阳性率仅为16％。可见，ADA活性升高是肝硬变所致。在各型急性肝炎病例中，甲型肝炎患者ADA和ALT均显著升高，乙型肝炎患者的ALT升高远大于ADA，非甲非乙型的肝炎病人则ADA升高幅度大于ALT。而且此型肝炎病人中的ADA极度升高者多易转变为迁延性肝炎。在慢性肝炎病中，乙型患者ADA高于非甲非乙型者，活动型又比非活动型高。测定ADA可反映非甲非乙型慢性肝炎的活动度，有助于疗效的判断。阻塞黄疸患者大多数血清ADA活性正常，而肝细胞性黄疸病人血清ADA活性大多数升高，因此测定血清ADA活性有助于两类黄疸的鉴别诊断。其他疾病，结合型胆膜炎、传染性单核细胞增多症、栗粒性结核、风湿热、溶血性贫血、白血病以及部分肿瘤病人均有部分病人的血清ADA呈不同程度的增高，慢性活动性结节病得发期病人血清ADA活性升高。

目前，普通偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶的试剂基本上都是按照次黄苷偶联PNP和XOD酶促反应以及Trider反应联合使用来设计的，由于PNP和XOD酶的稳定性比较差，导致即使将试剂保存在冷藏环境中，也不容易得到可靠的测定结果，并且容易造成试剂的浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶诊断试剂稳定性的方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明的技术原理：

ADA催化腺苷脱氨生成次黄苷，次黄苷经嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)作用，生成次黄嘌呤；后者在黄嘌呤氧化酶(XOD)的催化下，生成尿酸和过氧化氢(H2O2)；在过氧化物酶的存在下与EHSPT、4AAP反应，生成有色醌，醌的含量与ADA活性成正比，动态检测有色醌的生成速率，可求得ADA活性。

(一)原理反应式如下：

腺苷+水 腺苷脱氨酶 次黄苷+NH₃

腺苷+单价磷酸盐 核苷磷酸酶(PNP) 次黄嘌呤+1-磷酸核糖

次黄嘌呤+水+氧 黄嘌呤氧化酶(XOD) 尿酸盐+过氧化氢

过氧化氢+还原性色原性体组合 过氧化物酶 有色醌+水。

本发明的方法，其特征在于，包括在酶促偶联方法检测腺苷脱氨酶浓度的试剂(以下简称基本试剂)中加入稳定剂的步骤；

所说的稳定剂包括乙二胺四乙酸钙(以下简称EDTA-Ca)、乙二胺四乙酸铁(以下简称EDTA-Fe)、钼酸钠、钼酸铵、谷氨酸钠、牛血清白蛋白或超氧化物歧化酶中的一种；

所说的稳定剂的种类和在基本试剂中的浓度范围如下：

EDTA-Ca                10～100mmol/L

EDTA-Fe                10～100mmol/L

钼酸钠                 5～100mmol/L

钼酸铵                 5～100mmol/L

谷氨酸钠               5～100mmol/L

牛血清白蛋白           8～10g/L

超氧化物歧化酶(SOD)    0.5～10.0KU/L

所说的基本试剂的组成和其组分的浓度如下：

试剂1(R1)    PH7.0

Tris-Hcl     50mmol/l

4AAP         2mmol/l

PNP          0.1u/ml

XOD          0.2u/ml

过氧化物酶   0.6u/ml

试剂2(R2)    PH4.0

Tris-Hcl     50mmol/l

腺苷         10mmol/l

EHPST    2mmol/l