[发明专利]抗人精浆蛋白特异性单链抗体的制备及应用方法

权利要求书

1、一种抗人精浆蛋白特异性单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，设计引物，采用聚合酶链技术获取抗人γ-精浆蛋白单链抗体基因片段：引物设计为在氨基末端带有组氨酸尾巴和跨膜肽苏氨酸-丙氨酸-苏氨酸，上游引物为：5’-CGCTTAATTAAA AAG CAG ACC GCG ACC CAT ATG ACC CAG GTC CAACTG CAG-3’，下游引物为：5’-TTAGTTAGTTACCGGATCCC ACG TTT GAT CTC CAG-3’，总长度783bp，然后应用聚合酶链反应获取抗人γ-精浆蛋白单链抗体基因片段；

第二步，使用抗人γ-精浆蛋白单链抗体基因片段作模板制备抗人γ-精浆蛋白单链抗体。

2、根据权利要求1所述的抗人精浆蛋白特异性单链抗体的制备方法，其特征是，所述应用聚合酶链反应获取抗人γ-精浆蛋白单链抗体基因片段，包含两步聚合酶链反应：

第-步，应用聚合酶链反应1获取特异性基因片段：10×PCR缓冲液3μl，2.5mmol/L碱磷酸脱氧核苷酸3μl，上游引物1μl，下游引物1μl，E4B7ScFv基因质粒模板2μl，25mmol/L氯化镁3μl，Taq聚合酶1μl，将灭菌去离子水定容到30μl；聚合酶链反应1条件为：94℃2分钟，然后94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共25个循环，最后72℃7分钟，产物作为聚合酶链反应2模板；

第二步，应用聚合酶链反应2获取足够量的线性特异性基因片段：

上游引物：5’-CGCTTAATTAAA AAG CAG ACC GCG-3’，下游引物：5’-TTAGTTAGTTACCGGATCCC-3’，10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/L碱磷酸脱氧核苷酸5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，PCR反应1产物模板5μl，25mmol/L氯化镁5μl，Taq聚合酶1μl，将灭菌去离子水定容到50μl；聚合酶链反应2条件为：94℃4分钟，然后94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共25个循环，最后72℃10分钟，获得的线性抗人γ-精浆蛋白单链抗体基因片段作为下一步反应的模板。

3、根据权利要求1所述的抗人精浆蛋白特异性单链抗体的制备方法，其特征是，所述使用抗人γ-精浆蛋白单链抗体基因片段作模板制备抗人γ-精浆蛋白单链抗体，具体为：大肠杆菌提取物12μl，反应缓冲液10μl，氨基酸溶液12μl，蛋氨酸1μl，重构缓冲液5μl，模板10μl，总体积50μl，反应条件：30℃6小时，获得产物通过包被有抗组氨酸抗体的镍柱快速纯化。

4、一种应用抗人精浆蛋白特异性单链抗体的方法，其特征在于，将抗人γ-精浆蛋白单链抗体与磁性纳米粒子连接，包括以下步骤：

(1)制备树形分子包裹的磁性纳米粒子

采用常规共沉淀法制备磁性纳米粒子，用胺基硅烷对磁性粒子的表面进行修饰后，获得伯胺基表面的磁性纳米粒子，伯胺基表面的磁性纳米粒子与酯基端的树形分子进行共价结合，形成树形分子包裹的磁性纳米粒子；

(2)将树形分子包裹的磁性纳米粒子与单链抗体连接成复合物

在戊二醛作用下，树形分子修饰的磁性纳米粒子与抗人γ精浆蛋白单链抗体混合，混合条件是：1ml 0.85mg/ml单链抗体与1ml 2.5mg/ml树形分子修饰的磁性纳米粒子直接混合，在4℃反应10小时，然后，加入氨基乙醇，在25℃搅动反应2小时，利用磁铁，分离出单链抗体包被的磁性纳米粒子，在4℃保存备用。

5、根据权利要求4所述的应用抗人精浆蛋白特异性单链抗体的方法，其特征是，所述的单链抗体包被的磁性纳米粒子，结合酶联免疫反应，用于建立起检测血清中精浆蛋白含量的酶联免疫试剂盒；或结合蛋白芯片技术，用于建立起检测血清中精浆蛋白含量的蛋白芯片。

6、根据权利要求4所述的应用抗人精浆蛋白特异性单链抗体的方法，其特征是，所述的单链抗体包被的磁性纳米粒子，与核磁共振结合起来，作为造影剂，用于前列腺癌原位灶与转移灶的分子显像；或与治疗药物连接，随带治疗药物直接进入前列腺癌细胞中，或在体外施加磁场，增强前列腺癌治疗效果。