[发明专利]一种人源抗人组织因子Fab及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及应用天然的人源抗体基因库筛选具有抗凝血功能的 抗人组织因子Fab片段。本发明涉及到编码上述的Fab抗体、特别是编码该抗体V区 片段的DNA、以及编码含有V区的L链或H链的DNA。本发明还涉及含有该DNA 的重组载体、以及利用该载体转化的宿主。另外本发明还涉及以抗人TF的人源抗体 为有效成分的医药组合物和动脉粥样硬化的治疗药物。

背景技术

组织因子(tissue factor，TF)，又称凝血因子III，是一种分子量为47KD的跨 膜糖蛋白，其凝血功能已经众所周知，它与活化凝血因子VII(activated factor VII，F VIIa)结合后，形成TF/FVIIa复合物，启动外源性凝血途径；亦可激活凝血因子XI，启动内 源性凝血系统，是机体内活性最强的促凝物质之一，在生理性止、凝血过程及多种血栓 栓塞性疾病中发挥重要作用。同时，TF作为凝血系统中惟一在细胞表面表达的跨膜糖蛋 白，近期研究提示，TF具有信号传导受体的功能，可通过介导多种信号传导，影响肿瘤侵 袭与转移、胚胎发育、血管新生、炎症、动脉粥样斑块形成等多种病理、生理过程。

抗人组织因子抗体是否具有抗凝活性，不是取决于抗体与TF抗原点亲和力的强弱， 而是取决于其是否封闭了TF与下游相互作用的凝血因子的结合部位。如果抗人组织因 子抗体阻碍了TF与FVII的结合，可能会导致一系列的生理功能紊乱，但是如果仅是针 对TF和FX结合部位的抗体却能够阻止TF/FVIIa复合物的凝血激活作用，抑制凝血。

至今已经使用的众多抗凝血药物，包括肝素类药物、血小板聚集抑制物、凝血酶 抑制剂等，所针对的靶蛋白均位于凝血途径中的中下游，理论上都达不到最理想的抗 凝作用，且使用过程中可能出现由于过度抑制引发的出血等不良反应。研制能拮抗TF 促凝血作用的抗人组织因子抗体为研制防治血栓类疾病的新型药物奠定了基础，而一 些能作为有效抗凝剂的并能结合并中和TF或FVII/TF复合物或这两者的抗体已经 被描述例如抗TF的小鼠Mabs的治疗应用在美国专利US6,001,978和US5,223,427中有 记载；国际申请WO 99/51743涉及针对人的TF的人/小鼠嵌合单克隆抗体；欧洲专利申 请EP833911涉及针抗人TF的CDR接枝抗体；Presta L.等在《Thrombosis and Haemostasis》第85卷(3)pp.379-389(2001)中描述了抗TF抗体的人源化抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab及其制备方 法和应用。

本发明所述的人源Fab抗体选自天然的人源抗体基因库。

本发明提供了一种能编码识别人组织因子的人源Fab片段的基因序列，然而产生本 发明的基因序列的方法不受特别的限制。

所述的具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab，包括重链V区和轻链V区，含 有序列1和17的核苷酸序列。

所述的重链V区含有序列2的氨基酸序列；

上述的重链V区由由互补决定区(complementarity-determining region，CDR) 和框架区FR(framework region，FR)构成，所述CDR含有序列4、6和8的氨基酸 序列；所述的FR含有序列10、12、14和16的氨基酸序列。

所述的轻链V区含有序列18的氨基酸序列；

上述的轻链V区由互补决定区CDR和框架区FR构成，所述CDR含有序列：20、22 和24的氨基酸序列；所述的FR含有序列26、28、30和32的氨基酸序列。

含有编码本发明的人源抗组织因子Fab片段基因的质粒载体构成了本发明的一个 部分。

本发明提供了一种质粒载体，含有编码所述的重链V区的DNA和所述的轻链V区的 DNA，它能插入编码本发明的人源抗组织因子Fab片段的基因。本发明的质粒不受特别 限制，优选pFab-His2。

表达本发明的人源抗组织因子Fab片段的宿主细胞构成了本发明的一个部分。

本发明提供了一种宿主细胞，它能表达本发明的人源抗组织因子Fab片段。

本发明的宿主细胞不受特别的限制，可选自大肠杆菌、酵母或真核细胞，，优选大 肠杆菌JM109感受态细胞。