[发明专利]基于量子点标记的免疫印迹检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米技术领域的蛋白质检测方法，具体说是一种基于量子点标记的免疫印迹检测方法。

背景技术

常规免疫印迹(Western Blots)是采用化学发光和辐射技术。应用传统的有机荧光发色团的免疫印迹分析技术有其固有的局限性。低的荧光稳定性使其很难在长时间段成像，从而使检测灵敏度低。因为不同的发色团需要不同波长激发光源，而且需要很复杂的设计平台，因此多通道技术也是不可能的。另外，染料宽的发射光谱使得多通路互相重叠而产生干扰。

量子点(QDs)特指半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米颗粒，大小均匀的半导体量子点发射光谱窄且具有尺寸“调谐”特性，用单个波长即可激发不同的量子点，荧光量子产率高，稳定性好，具有很好的生物相容性等优点。而且近年来量子点丰富的光学特性及其在生物学标识方面巨大的研究和应用价值逐步被看好。量子点独特的光学性能使得连接有蛋白或者二抗的量子点可以作为免疫印迹的优良的荧光成像剂。量子点光稳定性的增强有利于信号稳定性以及高质量的分析。另外，宽的吸收峰和窄的发射峰使得在一个简单的系统中多色多通道成为可能。单一、便宜的紫外激发光源激发就可以得到490nm到680nm范围的发射波长。

量子点基础上的免疫印迹不但可以多色检测，而且价钱便宜，并具有以下优点：光稳定性增加，高灵敏度，与现有化学发光方法比较灵敏度高或者相当；多通道，大容量；线性强，提高蛋白表达量；比增强型化学发光试剂(ECL)便宜；与现有的成像系统相容，不用专用设备；不用暗室，胶片，不用冲洗，节约时间和成本；不用脱模；多色检测，可以在同一个检测窗口观察到多个抗体的存在并决定他们的浓度，比单色检测降低成本。用量子点标记的免疫印迹检测方法，分析转换信号可以大大加速并且提高灵敏度和准确度。

经对现有技术的文献检索发现，Richard L Ornberg等在《Nature Methods》(自然方法)2，79-81(2005)上发表，Western blot analysis with quantumdot fluorescence technology：a sensitive and quantitative method formultiplexed proteomics(用量子点的一光技术进行免疫印迹分析：灵敏、定量的多元检测方法)。该文是在同一个检测点用多种量子点标记进行多元蛋白质和蛋白质状态定量检测，要求不同波长的量子点同时应用，且定量分析。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于量子点标记的免疫印迹检测方法，使其利用量子点的荧光特性，将其与抗体偶联，直接进行蛋白免疫印迹检测，可以大大加速并且提高灵敏度和准确度。本发明是简单直接的定性分析方法，更简单易行，适用于非定量蛋白质及其功能检测。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用量子点标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与量子点标记的第二抗体起反应，在紫外灯下，量子点发射荧光以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。用简单紫外成像系统配备不同的滤光片可以得到免疫印迹图像。

本发明方法具体包括以下步骤：

第一步.量子点与抗体的连接

将表面带有羧基的量子点分散在硼酸盐缓冲溶液(pH＝9.18)中，加入硫化二亚胺(EDC)和二抗，漩涡混合振荡均匀，在室温下反应。反应溶液离心，用磷酸缓冲溶液多次洗涤，得到量子点和二抗连接物(量子点标记的二抗)。

第一步中，在室温下反应时间为3小时。

第一步中，所述硼酸盐缓冲溶液，其pH＝9.18；所述磷酸缓冲溶液，其浓度为0.1M，pH＝7.8。

第一步中，所述恒流转膜，是指60mA恒流转膜2小时。

第二步.免疫印迹过程

电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇浸泡后的PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，夹在六层滤纸中间，放到半干式电转仪上，恒流转膜；

免疫反应：将转好的膜放到TBST溶液中清洗，加入含5％脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床封闭，之后加入1∶1000稀释的单抗，摇床孵育，TBST溶液清洗两次，加入1∶500稀释的量子点标记的二抗，在避光条件下孵育，TBST清洗三次；