[发明专利]通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法

权利要求书

1.一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括步骤：

(1)第一步酶催化反应体系

空白组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL 50mM草酸和0.1mL处理失活的草酸脱羧酶酶液

待测样品组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL 50mM草酸和0.1mL待测草酸脱羧酶酶液v

第一步酶催化反应体系总体积V₂为0.5mL，反应pH为3.0～3.7，反应温度为30～37℃，反应时间T为30～60min；

(2)第二反应体系

空白组和待测样品组都为：1.0mL CO₂试剂

其CO₂试剂的组成为8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的苹果酸脱氢酶的pH 7.3～8.5 Tris-HCl缓冲液；

第二反应体系在30～37℃温育5～10min，380nm条件下测定A₁；

(3)第三反应体系

空白组：混合1.0mL CO₂试剂和0.01～0.1mL上述第一步酶反应空白组液V₃

待测样品组：混合1.0mL CO₂试剂和0.01～0.1mL上述第一步酶反应待测样品组液V₃

第三反应体系总体积V₁为1mL+V₃，30～37℃，5～10min，pH 7.3～8.5，380nm下测定A₂，计算ΔA＝A₁-A₂；

(4)计算草酸脱羧酶活力U/mL

一个酶活单位定义为在30～37℃，pH 3.0～3.7，一个大气压下，每分钟生成1μmol二氧化碳的量，体积酶活定义为每mL草酸脱羧酶酶液中的酶活力单位数，体积酶活单位为U/mL；

公式(1)

其中，ΔA_380nm＝ΔA_样品-ΔA_空白

V₁——最后的反应液总体积(mL)

T——第一步草酸脱羧酶反应时间(min)

v——待测酶液样品体积(mL)

V₂——第一步酶反应液总体积(mL)

V₃——参加第三步反应的酶反应液体积(mL)

d——比色皿光路直径(cm)

ε₁——NADH在380nm处的吸收系数(1.33L·mmol^-1·cm^-1)。

2.根据权利要求1所述的通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，其特征在于：步骤(1)中处理失活的草酸脱羧酶酶液是通过沸水浴15min-20min处理失活。