[发明专利]定向积累杀念菌素单一组份FR－008－III的基因工程菌株

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药技术领域的菌株，特别是一种定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III(Candicidin D)的基因工程菌株。

背景技术

链霉菌属原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群之一。很多聚酮类抗生素产生于这类细菌，并且已广泛应用于医用、兽用及农用，这包括红霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿维菌素(抗寄生的)和纳巴霉素(免疫抑制剂)等。

聚酮合酶(PKS)是可以催化合成一大类长度、功能基团和环化状态不同的聚酮大环内酯类天然产物的多功能酶类。PKS催化模式类似于经典的脂肪酸合成酶(FAS)的功能模式。聚酮合酶分为I型(Type I PKS)和II型(Type II PKS)两类。大环内酯类化合物如杀念菌素、红霉素以及夹竹桃霉素等由I型聚酮合酶负责合成。I型聚酮合酶体系由几个多功能酶组成，每个多功能酶都包含参与聚酮生物合成过程所需的各种催化功能域，这包括：酰基转移酶(AT)、酮基合成酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酮基还原酶(KR)、脱水酶(DH)或烯醇还原酶(ER)。其中KS、AT、ACP是负责聚酮链延伸所必须的功能域，其余非必须的功能域(KR、DH、ER)则负责聚酮链上功能基团(酮基，羟基，碳碳单键或双键)的变化。由于每一功能域只参与整个聚酮碳链合成中的一步生化反应，这样聚酮链的长短以及功能团的变化便取决于聚酮合酶上功能域的数量，种类及其排列组合。II型聚酮合酶与I型聚酮合酶的差别仅在于前者的功能域在聚酮链延伸的反应步骤中被重复使用。

七烯大环内酯类抗生素杀念菌素(FR-008/Candicidin)由链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)产生，其合成机制已被阐明，属于典型的I型聚酮合酶工作模式。文献报道七烯大环内酯类抗生素对真菌细胞膜中数量最大的固醇麦角固醇具有很大的亲和性，从而对真菌细胞具有选择性的毒性。杀念菌素是治疗人类严重系统性真菌感染最重要的抗生素之一。杀念菌素复合物的主要包含三个组份：FR-008-III(Candicidin D)、FR-008-V和FR-008-VI，其中以FR-008-III(Candicidin D)为主要活性组份。

根据杀念菌素生物合成模型以及杀念菌素3个组份的结构差异，推测杀念菌素生物合成过程中的两个催化功能域(KR21和DH18)的非完全活性可能导致了杀念菌素3个组份的同时生成。通过在染色体上定点突变的方法使KR21和DH18功能域失去催化活性，从而得到相应的突变株。对突变株发酵产物的高压液相和质谱分析(LC-MS)结果印证了这一推论，即KR21功能域的突变失活导致了FR-008-V的丢失；DH18功能域的突变失活导致了FR-008-VI的丢失；KR21和DH18功能域均突变失活后，仅定向积累FR-008-III(Candicidin D)。

发明内容

本发明的目是获得能单一积累杀念菌素复合物中最具药用价值的定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，使得本发明可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在杀念菌素产生菌链霉菌FR-008染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位点均发生了突变，KR21突变为：聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸突变为苯丙氨酸；DH18突变为：聚酮合酶FscE第3084位组氨酸突变为酪氨酸以及第3083位天冬氨酸突变为缬氨酸。该基因改造所得到的工程菌株ZYJ-6仅生产杀念菌素活性组份FR-008-III，而不再积累原始组份FR-008-V和FR-008-VI。

该基因工程菌株的构建方法：

(一)确定功能域KR21(存在于聚酮合酶FscF)和DH18(存在于聚酮合酶FscE)的催化活性位点。(二)设计并构建分别用于对KR21和DH18的催化活性位点进行突变的同源重组载体pJTU573和pJTU572。(三)把pJTU573通过接合转移导入菌链霉菌FR-008进行同源重组。(四)首先通过硫链丝菌素抗性影印筛选，进而通过PCR以及对PCR产物酶切验证和测序验证的方法最终筛选到KR21突变株。(五)同样方法，把pJTU572导入KR21突变株进行同源重组，最终筛选到KR21和DH18双突变株ZYJ-6。