[发明专利]利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种检测方法，具体是一种利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

发展一种能够快速、灵敏、可靠基因检测方法得到了越来越多的重视。传统的Northern杂交和狭缝杂交需要太长的时间，同时操作十分复杂。近年来发展起来的基因芯片技术，尽管能够高通量的检测基因表达，但是是一种成本很高的方法。荧光定量PCR技术具有很高的检测灵敏度，它需要纯化质量非常高的RNA，不然会抑制后续的反转录和PCR反应。三明治杂交技术检测快速，甚至无需核酸纯化，在检测的特异性方面有所欠缺。

S1酶是一种从米曲霉Asperillus oryzae分离出来的单链特异性核酸内切酶，分子量为32KD，在低pH值环境(pH值4～4.5)作用，需Zn²⁺参加。热稳定性好，在底物存在的条件下，65-70℃还有活性。一般仅作用于单链DNA或RNA，或双链核酸中的单链区，产生带5′-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。具有高度的单链切割特异性，广泛用于SNP(单核苷酸多态性)的检测。

经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号：CN 100352937C，发明名称：对藻类进行定性与定量分析的方法，该发明提出了一种针对rRNA的S1酶保护分析探针和夹心杂交技术，用来检测海洋藻类的种类和数量，但是该方法所用到的夹心杂交技术步骤比较繁琐，而且所采用的探针数量多，增加了检测成本。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用S1酶切割单链核酸特性的RNA定量检测方法，使其利用S1酶的单链切割特性，开发了一种无需RNA纯化，具有高度特异性的RNA快速检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体包括以下步骤：

第一步：捕获探针固定：将5’端标记有生物素的捕获探针固定于预先包被有链亲和素的酶标板上。此一步骤的关键是固定的捕获探针的量要适中，太少的探针会导致检测信号太小，监测范围减小；太多的捕获探针会造成材料的浪费，同时捕获探针之间会有一定程度的结合，对检测不利。本发明固定的捕获探针的浓度在5nM-50nM。

捕获探针与信号探针是一对互补探针，其长度在于35nt-45nt。探针长度增加会延长杂交时间，探针长度太短不能保证足够的特异性。信号探针与目标RNA的某一特定区域互补。信号探针和捕获探针的5’或3’端带有标记物，常用的标记物有(但不限于)：地高辛、生物素、荧光素等。

第二步：细胞破碎和胞内RNA的释放：本发明采用超声破碎法。由于在细胞破碎的过程中，会引起内源RNA酶的释放，需要抑制这些酶的活性，同时又不能引起后续S1酶活性的丧失。故在裂解杂交液中加入了甲酰胺，用于变性RNA酶，同时在裂解液中还加入了酵母tRNA，双重保护目标RNA不被降解。

本发明使用的裂解杂交液，其组成成分是80％甲酰胺(体积比)，400mM的NaCl(氯化钠)，5mM的Na₂EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，1％的SDS(十二烷基磺酸钠)以及0.5％的酵母tRNA。加入的甲酰胺能使RNA酶失活，加入的酵母tRNA能进一步保护目标RNA不被降解，加入的Na₂EDTA能结合体系中的重金属离子，加入的NaCl和SDS有利于信号探针与目标RNA的杂交。

所述的裂解杂交液是指菌体超声破碎和信号探针与目标RNA杂交的溶液环境。

第三步：信号探针与目标RNA杂交：取超声破碎后的裂解杂交液，加入信号探针，变性后杂交。

所述变性后杂交，是指在94℃变性5min后杂交。

第四步：S1酶消化多余探针：杂交完成后，加入S1酶消化液。由于杂交的环境不适合S1酶消化，需要对S1酶消化液进行优化，使得S1酶消化液加入体系后，溶液体系适合S1酶的消化。由于S1酶切割单链核酸的特性，S1酶能将体系中的游离信号探针、RNA以及RNA/信号探针杂交体的单链部分切割，剩下与目标RNA完全杂交的目标RNA/信号探针杂交体。

所述的S1酶消化液，是指含有S1酶的，加入到杂交后的溶液中消化游离信号探针、RNA以及RNA/信号探针杂交体的单链部分，是本发明的关键。优化后的S1酶消化液组成如下：2U/μl的S1酶，25mM的ZnSO₄，50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.2。