[发明专利]利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及重组大肠杆菌高效表达丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺。

背景技术

丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase，EC 1.2.3.3)是一种非常重要的临床诊断用酶，其最重要的应用是用于血液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活力测定；此外还可以用于丙酮酸测定、丙酮酸激酶活性测定等。

目前商业化生产的丙酮酸氧化酶主要来源于野生型植物乳杆菌和绿色气球菌，酶产量仅有120U/L，发酵水平低下，导致丙酮酸氧化酶市场价格高居不下。

由于丙酮酸氧化酶具有广泛的应用价值，因此进一步提高其产量是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产丙酮酸氧化酶的方法，所述方法可大大提高丙酮酸氧化酶的产量，成本低廉。

在本发明的第一方面，提供一种发酵生产丙酮酸氧化酶的方法，所述的方法包括：

(1)在37±1℃的培养温度下，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌，从而表达丙酮酸氧化酶；和

(2)当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，将温度由37±1℃降低到32±2℃(优选32±1℃)，保持该温度至发酵结束。

在本发明的优选例中，所述的生产丙酮酸氧化酶的方法是一种分批式补料发酵的工艺。

在另一优选例中，在步骤(2)中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，采用梯级降温的方式将温度由37±1℃逐渐降低到32±2℃(优选32±1℃)，至发酵结束。

在另一优选例中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1±0.2℃；之后每隔4±1小时降1±0.2℃，直至温度为32±1℃后保持恒温，至发酵结束。

在另一优选例中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1℃；之后每隔4小时降1℃，直至温度为32℃后保持恒温，至发酵结束。

在另一优选例中，所述的重组大肠杆菌是E.coli DH5α/pSMLPyOD。

在另一优选例中，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌所用的初始培养基含有：

甘油6-18ml/L；蛋白胨12-20g/L；酵母提取物10-16g/L；硫酸铵3-7g/L；硫酸镁1-4g/L；磷酸盐4-8g/L；氯化钠6-15g/L。

在另一优选例中，所述的磷酸盐组成为：磷酸二氢钾∶磷酸氢二钠∶磷酸氢二钾＝1∶2∶1。

在另一优选例中，所述的培养基中还含有微量元素1-2.2ml/L；其中所述的微量元素含有：FeSO₄·7H₂O 12.8±3g/L；ZnSO₄·7H₂O 2.84±1g/L；CuSO₄.5H₂O1.6±0.5g/L；MnSO₄·H₂O 3.2±1g/L；CaCl₂0.28±0.08g/L；CoCl₂·6H₂O 1.6±0.5g/L；H₃BO₄ 0.24±0.08g/L；Na₂MoO₄12.8±3g/L；和KI 0.16±0.05g/L。

在另一优选例中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，开始补充补料培养基。

在另一优选例中，所述的补料培养基含有：甘油，20±5％，蛋白胨，4±1％，酵母提取物，3±1％，硫酸铵，1±0.3％，磷酸盐，1.4±0.4％，微量元素母液，0.125±0.03％。

在另一优选例中，补料培养基的补充速率为0.2±0.1ml/min/L。

在另一优选例中，在重组大肠杆菌发酵过程中，以氨水控制pH在6.5-7.1。

在另一优选例中，发酵的时间是40±10小时(较佳的为40±5小时)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.实施例1发酵过程及产酶曲线。其中，

图1A显示了发酵过程中的生物量，甘油剩余量和温度的变化。

图1B显示了发酵过程中丙酮酸氧化酶(PyOD)的产量。

图2.实施例2发酵过程及产酶曲线。

图2A显示了发酵过程中的生物量，甘油剩余量和温度的变化。

图2B显示了发酵过程中丙酮酸氧化酶(PyOD)的产量。