[发明专利]一种等温双向生长的基因合成方法

权利要求书

1、一种等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的基因合成方法具体包括以下步骤：

(1)、根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，或者纯化合成的寡核苷酸链；

(2)、将步骤(1)中所得的寡核苷酸链混合在反应体系中，并加入具有聚合酶、连接酶和限制性内切酶三种活性的混合酶，在多种酶的协同作用下进行等温双向生长并发生延伸反应，合成目标DNA长链。

2、根据权利要求1所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的设计并合成用于延伸的寡核苷酸链构成方法如下：

(1)将目标DNA双链的其中一条连续单链记为正链，另一条连续单链记为负链，方向皆为5’-3’；

(2)将目标DNA双链分段成多个首尾相接的短序列，这些短序列由正链部分和负链部分组成；

(3)在这些短序列中选取一段作为延伸核心；

(4)将位于延伸核心与正链5’端之间的短序列记为左向延伸序列，将位于延伸核心与正链3’端之间的短序列记为右向延伸序列；

(5)在左向延伸序列正链部分和右向延伸序列负链部分的5’端首先加上一个限制性内切酶识别位点，然后再加入一段序列，这段序列与相应延伸序列的一部分互补，使得整段序列能形成一个发夹结构，发夹的开环部分为平末端；

(6)在延伸核心的正链部分、延伸核心的负链部分和所有发夹的3’端添加一段序列，这段序列由分段方式和限制性内切酶的切割方式所决定，这样在每个发夹的开环部分构建得到一个3’突出的互不相同的连接末端；由延伸核心构建得到的序列记为核心引物，由延伸序列构建得到的序列记为延伸引物；

(7)核心引物可由两段部分匹配的单链互为模版延伸后经限制性内切酶切割得到；

3、根据权利要求2所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的分段所得的短序列其长度为至少5个碱基。

4、根据权利要求2所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的引物是指寡核苷酸链。

5、根据权利要求1所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的纯化是指中性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

6、根据权利要求1所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的聚合酶为DNA聚合酶、RNA聚合酶，或者无3’-5’外切酶活性的聚合酶；所述的连接酶是指能够将两条DNA或RNA进行连接的酶；所述的限制性内切酶是指type II型的，切割后的序列是3’悬挂的限制性内切酶。

7、根据权利要求1所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的混合酶是指由Klenow exo^-聚合酶、T4 DNA连接酶和BtsI限制性内切酶组成的混合物。

8、根据权利要求7所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：在所述的三种酶的混合物中，Klenow exo^-聚合酶的浓度在0.001单位/微升到0.05单位/微升之间；T4 DNA连接酶的浓度在1单位/微升到30单位/微升之间；BtsI限制性内切酶，其终的浓度在0.00001单位/微升到1单位/微升之间。

9、根据权利要求1所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的延伸反应，在3个步骤的循环间进行：

(1)聚合酶延伸使得发夹结构打开，限制性内切酶位点成为双链；

(2)限制性内切酶对已经成为双链的位点进行切割；

(3)连接酶将切割产生的末端与体系中存在的某个发夹结构进行连接；

10、根据权利要求1所述的等温双向生长的基因合成方法，其特征在于：所述的合成过程温度在25℃至40℃之间。