[发明专利]光激化学发光免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及光激化学发光技术。

背景技术

光激化学发光技术是一种以高分子微粒为基础的化学发光技术，它可以通过感光微粒和发光微粒在一定距离范围内结合，产生离子氧能量传递，发出光信号，从而对待测样品进行检测。感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒，发光微粒是填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。光激化学发光技术的核心原理是能量的近距离转移，转移的介质是高能态的离子氧。当红色激光照射感光微粒后，释放单线态氧离子(4μs)，其传播距离为200nm左右，只有当感光微粒和发光微粒的距离足够接近的情况下，感光微粒释放的单线态氧离子才能到达发光微粒，从而产生一系列化学反应，发射出520～620nm高能级的光，由于反应体系中，微粒的浓度很低，碰撞几率非常小，因此本底信号微弱，只有感光微粒和发光微粒通过免疫反应结合以后，才会发射出明显的光，因此系统灵敏度很高。相对于传统的酶联免疫分析方法，它具有均相(免冲洗)、灵敏度高和操作简便等特点，并且易于实现自动化，因此其应用前景十分广阔。

本发明正是针对以上技术原理进行了深入的研究，开发出了以上技术原理的应用条件，确定了激发光最优化激发功率及波长，发射光光源的最优化检测波长，发射光最优化检测延迟时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种光激化学发光免疫检测方法，从多方面对其检测条件进行优化。

本发明公开了一种光激化学发光免疫检测方法，包括下列步骤：

a.以620-700nm的激发光照射含有发光微粒及感光微粒的反应溶液；

b.检测反应溶液的发射光量，发射光的检测波长为450-650nm。

上述步骤a以激发光照射反应溶液到步骤b检测反应溶液发光量之间有一检测延迟时间，其范围为10ms-1000ms。

上述步骤a以激发光照射反应溶液的时间为50ms-2000ms；优选200ms-1800ms，激发最佳为500-1000ms。

较佳的，上述激发光的波长范围为640-680nm，优选660nm，发射光的检测波长范围为610-620nm，优选615nm。

较佳的，激发光光源的功率范围为5-100mw，优选40-60mw。

上述发光微粒及感光微粒包被有抗原或抗体。

上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen等，该微粒可由市场上购得。发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，如羧基，醛基，胺基，环氧乙基或卤代烷基等各种已知的可连接蛋白质的官能团。

上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒，在红色激光激发下，可以产生单线态氧离子。当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生一定波长的光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。

上述反应溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，如庆大霉素和Proclin 300。

本发明的关键在于，经过研究光激化学发光免疫检测方法中激发光、发射光、检测时间等选择条件，给出了相应参数合适检测的选择范围，及优选的参数范围，从而使得光激化学发光免疫检测方法的可控性更强，灵敏度及精确度得到进一步地提高。

上述光激化学发光免疫检测方法可以有多种应用，如用于生物活性物质的定性或定量检测。在生物活性物质定性或定量检测中，可采用双抗体夹心法。即可将发光微粒包被抗原或抗体，而后将待测抗体或抗原，与标记蛋白(如生物素)标记的抗原或抗体一起进行孵育反应，再与包被有抗标记物(如亲和素)的感光微粒混合孵育获得反应液，所谓抗标记蛋白即为可与标记蛋白特异性结合的蛋白，而后采用前述条件进行激发光照射并检测发射光量，从而达到定性或定量检测目的。反之亦可，即将感光微粒包被抗原或抗体，而后待测抗体或抗原，与标记蛋白标记的抗原或抗体一起进行孵育反应，再与包被有抗标记蛋白的发光微粒混合孵育，而后采用前述条件进行激发光照射并检测发射光量。